吳婭妮，韋曉潔，高雨桐，陳 銘，韋秀莎，黃仁彬△，張士軍△

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，南寧 530299）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病[1]，長期的高血糖會導致多種糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生，包括腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、中風、心血管疾病和周圍血管疾病等[2]。糖尿病心肌病是糖尿病心血管并發(fā)癥最常見的疾病之一，其發(fā)病機制復雜，由多因素造成[3]，氧化應激反應參與調(diào)節(jié)并啟動的細胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要機制[4]。李偉斯等[5]已報道楊桃根總提取物能夠在降低糖尿病大鼠血糖的同時降低血清中心肌酶活性，對糖尿病大鼠心肌損害有一定的預防治療作用。而2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮（2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione，DMDD）是從楊桃根提取分離所得的黃酮類單體化合物，楊桃根DMDD 具有良好的降血糖效果，能夠抑制糖尿病腎病及阿爾茨海默模型小鼠的氧化應激，減少細胞凋亡[6-7]。因此，本實驗通過復制糖尿病小鼠心肌損傷模型，探討楊桃根DMDD對糖尿病小鼠心肌損傷的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠共50只，6～8周齡，體重（18±2）g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002，實驗動物使用許可證號：XYKG桂2014-0003。

1.2 主要藥物與試劑 中藥材楊桃根采自廣西靈山縣，依據(jù)課題組前期制備方法[5]自行制備楊桃根DMDD。鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）試劑盒均購自上海執(zhí)誠生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）購自南京建成生物研究所；天狼星紅染色液購自安徽雷根生物技術有限公司；TUNEL試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒購自美國Axygen 公司；PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 模型制備及分組給藥 50 只雄性C57BL/6 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只小鼠作為空白組，剩余小鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，之后給予鏈脲佐菌素（STZ）100 mg/kg空腹腹腔注射，72 h后測空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L 視為造模成功。將造模成功的小鼠隨機分為模型組，DMDD 高（50 mg/kg）、中（25 mg/kg）、低（12.5 mg/kg）劑量組，每組10 只，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，灌胃給藥治療8周，1次/d，空白組灌胃等劑量蒸餾水。

1.4 血清指標檢測 給藥結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水12 h，摘除眼球收集血液，頸椎脫臼處死小鼠。血液室溫放置30 min，4 ℃下3 500 r/min 離心15 min，收集血清。全自動血生化分析儀檢測血清中CK、LDH 含量。使用ELISA 法檢測CK-MB 水平，嚴格按照說明書操作步驟進行。

1.5 心肌組織MDA、SOD、GSH 含量檢測 處死小鼠后，迅速取出心臟組織，用預冷的生理鹽水清洗殘留血液。取適量心肌組織，按照1∶9 的比例加入生理鹽水制備成10%心肌組織勻漿，4 ℃下3 500 r/min 離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD、GSH 含量，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。

1.6 心肌組織蘇木精－伊紅（HE）、天狼星紅染色和TUNEL 染色 取小鼠心臟1/3 的心尖處，放入4%多聚甲醛，固定24 h，常規(guī)脫水，進行石蠟包埋，切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)病理變化。切片常規(guī)脫蠟至水，行天狼星紅染色，滴染1 h，流水沖洗，蘇木精染細胞核，常規(guī)脫水、中性樹脂固封，于光學顯微鏡下觀察膠原纖維增生情況。切片參照TUNEL 試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測，于光鏡下觀察，細胞核染成棕黃色的為凋亡細胞。采用Image J圖像分析軟件計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。

1.7 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達 提取心臟組織總RNA，測定總RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7300 系統(tǒng)完成PCR擴增，反應條件如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列如下：Bax上游：5’-TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG-3’，下游：5’-CCATGATGGTTCTGATCAGCTC-3’；Bcl-2 上游：5’-GATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3’，下游：5’-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3’；Caspase-3 上游：5’-AGTGGGACTGAG GAGAT-3’，下游：5’-GTAACCAGGTGCTGTGAGGTAAG-3’；β-actin 上游：5’-GTCGAGTCGCGTCCACC-3’，下游：5’-GTCATCCATGGCGAACTGGT-3’。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DMDD 對小鼠血清中空腹血糖（FBG）、CK、CK-MB、LDH 水平的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清中的FBG、CK、CK-MB、LDH 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DMDD 各劑量組FBG、CK、CK-MB、LDH 水平明顯下降（P＜0.05 或P＜0.01），且DMDD 高、中劑量組FBG 低于DMDD低劑量組（P＜0.05），DMDD 高劑量組心肌酶低于DMDD低劑量組（P＞0.05），見表1。

表1 DMDD對小鼠FBG、CK、CK-MB、LDH的影響，n=10

表1 DMDD對小鼠FBG、CK、CK-MB、LDH的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.2 DMDD 對小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH 含量的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清中的MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD、GSH水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組小鼠相比，DMDD 能夠顯著提高小鼠SOD、GSH 含量，降低MDA 含量（P＜0.05 或P＜0.01），且DMDD 高劑量組與DMDD 低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 DMDD對小鼠心肌結(jié)構(gòu)、纖維增生和心肌凋亡的影響 HE 染色可見空白組小鼠心肌排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)較為完整；模型組小鼠心肌排列不規(guī)則，心肌間質(zhì)變寬，可見部分心肌纖維斷裂；DMDD 各劑量組小鼠心肌組織細胞排列稍亂，心肌斷裂減少。天狼星紅染色可見模型組心肌組織含有明顯紅色的膠原纖維，分布雜亂，空白組及DMDD 各劑量組紅色膠原纖維減少。TUNEL染色結(jié)果可見，與空白組相比較，模型組心肌組織有較多棕黃色凋亡細胞核，凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，DMDD各劑量組凋亡細胞均明顯減少，凋亡率明顯下降（P＜0.01），且DMDD 高劑量組凋亡率低于DMDD低劑量組（P＜0.05），見圖1、圖2。

表2 DMDD對小鼠MDA、SOD、GSH的影響，n=10

表2 DMDD對小鼠MDA、SOD、GSH的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

圖1 心肌組織HE、天狼星紅染色及TUNEL染色圖（×400）

圖2 5組心肌細胞凋亡率比較

2.4 DMDD 對小鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響 與空白組相比，模型組小鼠心肌組織中Bax、Caspase-3 mRNA表達水平顯著性升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，DMDD 治療組Bax、Caspase-3 mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），DMDD 高、中劑量組Caspase-3 mRNA表達低于DMDD低劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 DMDD對小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的影響，n=10

表3 DMDD對小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

3 討論

糖尿病發(fā)病率和死亡率逐年上升，給個人和社會造成了巨大壓力。糖尿病心肌病作為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，與糖尿病患者心力衰竭的高死亡率密切相關[8]。目前臨床上尚缺乏對糖尿病心肌病特異性、針對性的治療藥物。本研究利用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ 復制糖尿病心肌損傷模型，使糖尿病小鼠在持續(xù)的高糖環(huán)境下，心肌組織受到損傷，導致血清中的CK、LDH 及CKMB水平升高（P＜0.01）。CK、LDH及CK-MB均分布于心肌細胞中，是心肌疾病的常見診斷指標，特別是CK-MB，對心肌損傷有很高的特異性。當心肌組織受損，細胞通透性增加，血清中CK、LDH、CKMB水平隨之升高[9]。而DMDD能夠降低糖尿病小鼠血清中CK、LDH 及CK-MB 水平（P＜0.05），且在病理染色中可見DMDD 減少心肌斷裂及心肌膠原纖維生成，在一定程度上保護糖尿病心肌損傷。

糖尿病心肌病發(fā)病機制復雜，涉及的發(fā)病因素較多，線粒體產(chǎn)生的活性氧誘導氧化應激損傷心肌組織是其中重要的發(fā)病機制[4]。MDA 作為脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物之一，其水平的高低能夠反映細胞脂質(zhì)過氧化的嚴重程度[10]。SOD 在氧化應激中具有清除超氧陰離子的專有作用，其活力的高低反映了細胞清除自由基能力的大小。大多數(shù)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基由GSH 消耗，如果GSH 消耗過多或者產(chǎn)生不足就會導致組織的脂質(zhì)過氧化損傷[11]。檢測心肌組織內(nèi)的MDA、SOD和GSH含量，能夠間接表明心肌組織內(nèi)氧化應激水平。本研究中模型組小鼠心肌組織中的MDA 含量顯著性升高，SOD 和GSH 含量顯著性下降（P＜0.01），說明糖尿病小鼠心肌組織抗氧化能力下降。經(jīng)過DMDD 治療后，MDA 含量降低，SOD和GSH活性增強，表明DMDD能夠提高心肌組織的抗氧化能力，通過抑制氧化應激改善糖尿病心肌損傷。

心肌組織自由基增多，脂質(zhì)過氧化物累積，導致心肌細胞凋亡，而心肌細胞凋亡是心功能障礙發(fā)生的主要原因[12]。Caspase-3是Caspase家族中凋亡的關鍵執(zhí)行者，經(jīng)細胞內(nèi)的促凋亡基因Bax 激活下游基因使其活化[13]。Bcl-2作為細胞凋亡抑制基因，通過抑制線粒體細胞色素C 的釋放，抑制細胞凋亡[14]。本實驗利用TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡，qPCR檢測心肌組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達量，結(jié)果表明，模型組小鼠心肌細胞凋亡明顯增加，Caspase-3、Bax mRNA 表達量顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達量顯著下降（P＜0.01）。而DMDD 能夠減少心肌細胞凋亡，降低Caspase-3、Bax mRNA 表達，升高Bcl-2 mRNA 表達，提示DMDD可下調(diào)促凋亡基因表達，上調(diào)凋亡抑制基因表達，從而抑制心肌細胞凋亡。

綜上，楊桃根DMDD能夠減輕糖尿病小鼠的心肌損傷，其作用機制與DMDD 抑制氧化應激，減少心肌纖維增生，抑制心肌細胞凋亡有關。