陳 迪，譚少健，鄒文進(jìn)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021)

眼部化學(xué)燒傷在各種場(chǎng)合均很常見(jiàn)，眼化學(xué)燒傷的發(fā)生率占所有眼外傷的7.7%～18.0%，并且堿性燒傷通常比酸性燒傷的發(fā)生率更高、危害更大[1]。角膜堿燒傷由于纖維化引起的角膜混濁而導(dǎo)致不可逆的視力喪失通常需要進(jìn)行角膜移植以恢復(fù)視力，這仍然是一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)[2]。多西環(huán)素是一種四環(huán)素類抗生素，具有較強(qiáng)抗菌、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用，在角膜堿燒傷模型中具有強(qiáng)大的抗炎及抑制新生血管作用[3]。本課題組之前的研究已經(jīng)表明多西環(huán)素通過(guò)抑制TGF-β1及α-SMA的表達(dá)來(lái)減輕堿燒傷大鼠角膜混濁程度[4-5]，其具體抗纖維化機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。近年來(lái)的研究表明，角膜創(chuàng)傷后基質(zhì)細(xì)胞被激活產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）堆積在細(xì)胞間形成角膜混濁。波形蛋白(Vim)和纖維連接蛋白（Fn）被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物[6]，這種ECM蛋白是影響角膜纖維化的重要指標(biāo)。因此，本次研究以大鼠角膜堿燒傷為模型，觀察多西環(huán)素對(duì)堿燒傷大鼠角膜中Vim 和Fn 表達(dá)的影響，探索多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠54只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均通過(guò)裂隙燈排查眼前節(jié)疾病。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組和多西環(huán)素組，每組27 只（27 眼），均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 SD大鼠角膜堿燒傷模型的制備 堿燒傷模型制備前1 d 用5.0 g/L 妥布霉素眼液點(diǎn)眼4 次預(yù)防感染。按照4 mL/kg 體質(zhì)量向腹腔內(nèi)注射100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，丁卡因眼液滴眼行表面麻醉，棉簽擦干結(jié)膜囊內(nèi)多余液體。自制堿燒傷模具：200 μL容積的槍頭距尾部15 mm處水平切去槍頭前端，用刀片小心將切口端外部削薄，在槍頭內(nèi)填塞適量棉花，使槍頭切口端外露的棉花形成一個(gè)平整微凸面，松緊度適中，槍頭尾部用紙膠布封貼，高壓高溫滅菌備用。于模具內(nèi)滴入200 μL 1 mol/LNaOH，將模具垂直放置于大鼠右側(cè)角膜中央25 s，迅速用20 mL生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊1 min，沖洗完畢后可見(jiàn)角膜中央有一圓形灰白色燒灼斑，直徑約4 mm。顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)層水腫、混濁且虹膜隱約可見(jiàn)。堿燒傷后立即給予眼液滴眼，多西環(huán)素組以1.0 g/L 多西環(huán)素（美國(guó)Sigma）點(diǎn)眼，對(duì)照組以眼液溶媒點(diǎn)眼，溶媒除不含多西環(huán)素外，其余成分均與多西環(huán)素眼液相同，4次/d，20 μL/次，至臨床觀察期結(jié)束，即堿燒傷后第14天。

1.3 角膜渾濁程度評(píng)分 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14天對(duì)各組大鼠角膜進(jìn)行混濁程度評(píng)分。角膜混濁程度的評(píng)分參照Holland 等的標(biāo)準(zhǔn)[7]：0 分：角膜透明無(wú)混濁；1 分：角膜輕度混濁，虹膜紋理可見(jiàn)；2分：角膜混濁較重，虹膜紋理不清；3分：角膜混濁進(jìn)一步加重，但可見(jiàn)瞳孔；4分：角膜完全混濁，看不清瞳孔。

1.4 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14天每組隨機(jī)選取4只大鼠處死，用無(wú)菌手術(shù)器械沿角膜緣快速取下角膜，4%中性甲醛固定、常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精－伊紅（HE）染色及中性樹(shù)膠封片。于400 倍鏡下（日本Olympus）記錄各時(shí)間點(diǎn)切片中角膜周邊部、中周部及角膜中央共5 個(gè)視野，通過(guò)Image J 軟件進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)角膜中Fn mRNA和Vim mRNA的表達(dá) 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14 天每組隨機(jī)選取5 只大鼠處死，用無(wú)菌手術(shù)器械沿角膜緣快速取下角膜，將角膜組織于裝有裂解Buffer R1的1.5 mL離心管內(nèi)進(jìn)行勻漿，提取角膜組織總RNA（美國(guó)Axygen），進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并進(jìn)行qPCR 反應(yīng)（日本TaKaRa）。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s；Fn、Vim 及β-actin 均為40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列如下：Fn-F：5’-CCACCATCACTGGTCTGGAG-3’，F(xiàn)n-R：5’-GGGTGTGGAAGGGTAACCAG-3’；Vim-F：5’-TGCGGCTGCGAGAAAAATTG-3’，Vim-R：5’-GGTCAAGACGTGCCAGAGAA-3’；β-actin-F：5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，β-actin-R：5’-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3’。

1.6 免疫熒光檢測(cè) 采用石蠟切片（5 μm）進(jìn)行免疫熒光染色，抗原修復(fù)后用10%驢血清封閉30 min，加入Fn（1∶200）和Vim（1∶200）一抗（英國(guó)abcam），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，加入熒光二抗CY3 山羊抗兔（1∶300）/488 山羊抗小鼠（1：400）（武漢賽維爾生物）避光室溫孵育50 min，再加入DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min，最后淬滅組織自發(fā)熒光后用封片。于200倍鏡下（日本Olympus）各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3 個(gè)視野，采用Image J 軟件分別對(duì)Fn 及Vim的陽(yáng)性熒光面積進(jìn)行測(cè)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 角膜混濁程度評(píng)分 建模成功后第3、第7、第14 天在眼科顯微鏡下對(duì)各組大鼠進(jìn)行活體觀察。角膜堿燒傷后第3天：兩組均表現(xiàn)為角膜上皮缺損、基質(zhì)層水腫、混濁且虹膜紋理不清，兩組間角膜混濁程度評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。堿燒傷后第7 天：對(duì)照組角膜水腫較重、基質(zhì)混濁，瞳孔隱約可見(jiàn)；多西環(huán)素組角膜水腫較輕，虹膜紋理不清；多西環(huán)素組角膜混濁程度輕于對(duì)照組(P＜0.05)。堿燒傷后第14天：對(duì)照組可見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入堿燒傷區(qū)，瞳孔不可見(jiàn)；多西環(huán)素組角膜基質(zhì)水腫消退，角膜少量云翳，虹膜紋理清晰；多西環(huán)素組角膜混濁程度輕于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜混濁程度情況

表1 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜混濁程度評(píng)分分，

表1 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜混濁程度評(píng)分分，

與對(duì)照組比較，#P＜0.05。

2.2 角膜炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 在第3、第7、第14 天，多西環(huán)素組角膜炎癥細(xì)胞數(shù)量均少于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。角膜堿燒傷后第3天：兩組均表現(xiàn)為角膜上皮細(xì)胞水腫，2～3層細(xì)胞，基質(zhì)層水腫且排列疏松，但多西環(huán)素組炎癥細(xì)胞較少。堿燒傷后第7天：對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞稍水腫，4～6 層，基質(zhì)層水腫明顯，纖維排列紊亂，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；多西環(huán)素組角膜上皮細(xì)胞基本愈合，4～5層，基質(zhì)層水腫較輕，纖維排列尚規(guī)則，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。堿燒傷后第14 天：對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞4～6層，基質(zhì)層仍可見(jiàn)水腫，纖維排列不規(guī)則，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；多西環(huán)素組角膜上皮完全修復(fù)，纖維排列規(guī)則，極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。

表2 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)個(gè)，

表2 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)個(gè)，

與對(duì)照組比較，#P＜0.05。

圖2 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜炎癥細(xì)胞變化（HE，×200）

2.3 免疫熒光染色 角膜堿燒傷后第3、第7、第14天分別對(duì)兩組大鼠角膜進(jìn)行免疫熒光染色，紅色熒光代表Fn，綠色熒光代表Vim，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核。堿燒傷后第3、第7、第14 天多西環(huán)素組Fn 及Vim 的陽(yáng)性熒光面積（Area%）均較對(duì)照組?。≒＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 Fn mRNA和Vim mRNA的相對(duì)表達(dá)情況角膜堿燒傷后第3、第7、第14天多西環(huán)素組Fn mRNA 和Vim 的mRNA 水平均較對(duì)照組低(P＜0.05)，見(jiàn)表3、表4。

圖3 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜Fn及Vim免疫熒光強(qiáng)度（IF,×200）

表3 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜中Fn mRNA相對(duì)表達(dá)量以及蛋白水平比較

表3 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜中Fn mRNA相對(duì)表達(dá)量以及蛋白水平比較

與對(duì)照組比較，#P＜0.05。

表4 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜中Vim mRNA相對(duì)表達(dá)量以及蛋白水平比較

表4 堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組角膜中Vim mRNA相對(duì)表達(dá)量以及蛋白水平比較

與對(duì)照組相比，#P＜0.05。

3 討論

化學(xué)損傷引起角膜混濁的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的分子信號(hào)事件級(jí)聯(lián)，涉及多種纖維化途徑和ECM的重塑[8]。目前大部分學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)角膜受到創(chuàng)傷后，角膜基質(zhì)細(xì)胞激活、增生、轉(zhuǎn)化，激活的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量ECM堆積在細(xì)胞間，基質(zhì)纖維排列紊亂形成角膜混濁。Vim 是角膜纖維化中必需的Ⅲ型中間絲，被認(rèn)為是角膜纖維化的新靶標(biāo)[9-10]，在角膜被堿性物質(zhì)灼傷后，角膜基質(zhì)細(xì)胞激活并遷移至堿燒傷區(qū)轉(zhuǎn)化成高表達(dá)Vim的肌成纖維細(xì)胞[11]。Bargagna-Mohan等[12]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Vim的表達(dá)，可以降低堿燒傷角膜的纖維化，從而提高角膜透明度。Das 等[13]在角膜創(chuàng)傷模型中也有類似的發(fā)現(xiàn)，敲除Vim 可以預(yù)防角膜纖維化。Fn 是一種存在于角膜基質(zhì)層中的高分子糖蛋白，它的主要功能是連接細(xì)胞與基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞，在組織纖維化過(guò)程中起著重要作用。有研究表明，在大鼠角膜堿燒傷后Fn表達(dá)量急劇增加，它參與了堿燒傷角膜傷口的愈合過(guò)程[14]。Shi 等[15]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可以通過(guò)JNK 信號(hào)途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞中Fn的表達(dá)，最終導(dǎo)致角膜纖維化。因此，F(xiàn)n的過(guò)度表達(dá)也可能是造成角膜纖維化的重要原因。陶丹等[16]的研究驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，她發(fā)現(xiàn)減少ECM-FN 的表達(dá)可以減輕PKA 術(shù)后角膜基質(zhì)混濁的程度。Vim 及Fn 作為角膜基質(zhì)纖維化的新的標(biāo)記物，阻斷其表達(dá)可能成為治療角膜基質(zhì)混濁的新方法。

本次實(shí)驗(yàn)用眼科顯微鏡對(duì)堿燒傷后角膜混濁程度評(píng)分并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明堿燒傷后第3 天兩組角膜混濁程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在堿燒傷后的第7 天和第14 天，多西環(huán)素組均比對(duì)照組的角膜混濁程度輕（P＜0.05）；堿燒傷后第14天，對(duì)照組角膜基質(zhì)混濁，遮擋瞳孔，可見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入堿燒傷區(qū)，而多西環(huán)素組僅有少量角膜云翳，角膜幾乎恢復(fù)透明，表明多西環(huán)素可以有效減輕堿燒傷大鼠角膜的渾濁程度。

多西環(huán)素是四環(huán)素類抗生素，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。多西環(huán)素還有一定的抗纖維化作用，其抗纖維化作用主要是通過(guò)抑制ECM的生成和重塑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)Fn及Vim的調(diào)節(jié)作用已有報(bào)道，它可以抑制呼吸道上皮細(xì)胞中TGF-β1 誘導(dǎo)的Vim、Fn 以及α-SMA 的表達(dá)，減輕鼻旁竇黏膜破壞后引起ECM沉積，最終抑制鼻息肉的形成[17-18]；可以作為肝細(xì)胞癌上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成擬態(tài)的抑制劑，通過(guò)抑制間質(zhì)標(biāo)記物-Vim的表達(dá)來(lái)延緩上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的進(jìn)程，最終延長(zhǎng)肝細(xì)胞癌小鼠的生命[19]；還可以抑制平滑肌細(xì)胞中ECM蛋白Vim和Fn 的表達(dá)來(lái)減輕動(dòng)脈粥樣硬化[20]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組在堿燒傷后第3天炎癥細(xì)胞開(kāi)始增多，第7 天達(dá)到頂峰，第14 天時(shí)逐漸消退；對(duì)照組Fn 及Vim mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量在堿燒傷后第3天的時(shí)候也已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)增加，在第7天就達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的趨勢(shì)基本保持一致；筆者推測(cè)，F(xiàn)n 及Vim 的表達(dá)與角膜炎癥反應(yīng)可能存在一定的關(guān)系。多西環(huán)素組各時(shí)間點(diǎn)的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、Fn及Vim mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均較對(duì)照組輕（P＜0.05）。提示多西環(huán)素可降低Fn 及Vim 的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)。本課題組之前的研究已經(jīng)表明多西環(huán)素可以抑制堿燒傷大鼠角膜中NFκB、TGF-β1 及α-SMA 的表達(dá)，本次研究結(jié)果表明多西環(huán)素還可以抑制Fn 及Vim 的表達(dá)來(lái)減輕角膜纖維化，那么在堿燒傷模型中，F(xiàn)n 及Vim 的表達(dá)是否與TGF-β1、NF-κB 的表達(dá)有關(guān)，它們之間存在何種聯(lián)系，有待我們進(jìn)一步的研究。

綜上所述，多西環(huán)素可減輕大鼠角膜的渾濁程度，其可能通過(guò)減少ECM 蛋白Vim 及Fn 的沉積來(lái)減輕堿燒傷大鼠的角膜混濁程度。本次研究為角膜纖維化的機(jī)制和多西環(huán)素治療大鼠角膜堿燒傷提供了一定的依據(jù)和理論基礎(chǔ)。