段紹毅，王君輔，邱 越，王 冶，趙 昆，陳俊強

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧 530021）

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，伴有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，患者預(yù)后較差，盡管目前手術(shù)和輔助治療已有改進，但患者5 年總生存率仍低于25%[1]，仍是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，我國胃癌患者占全球胃癌患者總數(shù)的42.6%[4-5]。目前認為，胃癌患者的高死亡率主要歸因于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，即使在胃癌早期，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也超過10%[6-7]。了解胃癌轉(zhuǎn)移的分子和細胞機制將有助于鑒定有用的生物標記物，以及確定更有效的分子靶向治療。

光蛋白聚糖（lumican）是一種小的富亮氨酸重復(fù)序列家族蛋白聚糖[8]，是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，不僅可以調(diào)節(jié)細胞外水平衡、影響組織生物力學(xué)[9]，且在細胞增殖、遷移及調(diào)節(jié)生長因子的活性等方面也發(fā)揮著重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，lumican在多種腫瘤細胞中表達升高，參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[11-13]。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，lumican在胃癌細胞中高表達，其表達與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及生存率顯著相關(guān)。黏著斑激酶（FAK）是一種非受體型酪氨酸激酶，通過與細胞外基質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)細胞生長和遷移[15-16]。本研究進一步觀察lumican 在人胃癌組織中的表達，探討其對胃癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其與FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，為胃癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫信息收集 利用GEPIA2 軟件（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對腫瘤基因組圖譜項目數(shù)據(jù)庫進行分析，確定lumican 在癌組織及正常組織的表達差異，并對其進行生存曲線分析。

1.2 患者和組織樣本收集 收集在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的72 例原發(fā)性胃癌患者的胃癌組織和配對正常胃上皮組織。排除合并其他系統(tǒng)性腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移至胃，以及術(shù)前接受化療或放療的患者。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細胞和主要試劑 胃癌細胞株AGS 購自中國科學(xué)院細胞庫（中國上海）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco-BRI 公司；lumican 小干擾RNA（siRNA）、lumican過表達質(zhì)粒（Pex-RB-Mam-EGFPh-LUM）均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000 購自賽默飛公司；Transwell小室及人工基底膜購自康寧公司（美國）；lumican、FAK、磷酸化（p-）FAK 抗體均購自Abcam 公司（英國）。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 AGS 細胞置于含10%胎牛血清和1%青－鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基的6 孔板中，并在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%匯合度時，按照Lipofectamine 3000說明書分別將lumican siRNA（3.75 μg/孔）、lumican 過表達（OE）質(zhì)粒（4 μg/孔）及相應(yīng)的陰性對照（NC）轉(zhuǎn)入AGS細胞中，分為siRNA-NC組、siRNA組、NC組和OE組。未做任何處理的AGS細胞設(shè)為空白對照組（Control組）

1.5 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測lumican 表達 使用NucleoZOL RNA isolation 試劑提取胃癌組織和正常胃組織總RNA，HiScript RT 試劑盒（諾唯贊公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green PCR 試劑盒（諾唯贊公司）在ABI 7500 型PCR 儀上進行PCR 擴增，設(shè)定條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算lumican mRNA相對表達量。引物由上海生工生物公司設(shè)計并合成，引物序列如下：lumican上游：5’-TAACTGCCCTGAAAGCTACCC-3’，下游：5’-GGAGGCACCATTGGTACACTT-3’；β-actin 上游：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。

1.6 Western blotting 法檢測lumican、FAK 蛋白表達 提取Control組和轉(zhuǎn)染后48 h的AGS細胞總蛋白，Bradford試劑盒測定蛋白濃度；SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用5%脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗lumican、FAK、p-FAK（Abcam 公司，均1∶1 000）和GAPDH（CST 公司，1∶10 000）4 ℃冰箱孵育過夜；洗膜，二抗（CST 公司，1∶10 000）室溫孵育1 h；洗膜后，取適量發(fā)光液（賽默飛公司）置于暗盒中孵育1 min，凝膠成像系統(tǒng)中曝光并拍照。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 Transwell檢測細胞侵襲、遷移能力 將適量轉(zhuǎn)染的AGS 細胞用含1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基制成懸液加入到鋪有人工基底膜的Transwell 上室中，下層腔室加入5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)劑，細胞在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h；下表面遷移的癌細胞用95%酒精固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察、拍照，Image J軟件統(tǒng)計侵襲、遷移細胞數(shù)。

1.8 EDU檢測細胞增殖能力 將適量轉(zhuǎn)染的AGS細胞按照EDU 試劑盒說明書（碧云天生物公司）標記細胞后，使用4%多聚甲醛固定細胞，然后使用hoechst染料將細胞核染色，在顯微鏡下觀察、拍照，以EDU標記（紅染）的新增殖細胞數(shù)與hoechst標記（藍染）的總細胞數(shù)的比值為細胞增殖率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫信息分析結(jié)果 利用GEPIA2 軟件（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對腫瘤基因組圖譜項目數(shù)據(jù)庫進行分析。數(shù)據(jù)庫中408 例胃癌組織標本（胃癌組）和211例正常胃組織（正常組）mRNA表達數(shù)據(jù)顯示，lumican在胃癌組中的表達顯著高于正常組（logFC＞1，P＜0.05）；lumican 高表達組患者生存率顯著低于lumican低表達組（P＜0.05），見圖1。

2.2 lumican mRNA在胃癌組織中高表達 在收集的10 對胃癌組織與正常胃組織樣本中提取RNA后，進行qPCR 檢測，胃癌組織中l(wèi)umican mRNA 相對表達量為1.012±0.173，顯著高于正常胃組織的0.518±0.772（P＜0.05）。

2.3 沉默lumican 對AGS 細胞侵襲、遷移及增殖能力的影響 與siRNA-NC 組比較，siRNA 組AGS 細胞侵襲和遷移細胞數(shù)明顯減少，細胞增殖率明顯降低（均P＜0.05），見圖2、圖3。

2.4 過表達lumican 會引起AGS 細胞侵襲、遷移及增殖能力的增加 與NC組比較，OE組AGS細胞侵襲和遷移細胞數(shù)明顯增加，細胞增殖率明顯升高（均P＜0.05），見圖4、圖5。

2.5 lumican 表達對AGS 細胞FAK/p-FAK 通路相關(guān)蛋白表達水平的影響 沉默lumican后FAK和p-FAK蛋白相對表達量較對照組明顯降低（P＜0.01），同時過表達lumican后FAK和p-FAK蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01），見圖6。

圖1 Lumican在胃癌組織和正常組織中的表達及其表達對患者生存率的影響

圖2 Transwell檢測沉默lumican后AGS細胞侵襲遷移

圖3 Edu檢測沉默lumican后AGS細胞增殖

圖4 Transwell檢測過表達lumican后AGS細胞侵襲和遷移

圖5 Edu檢測過表達lumican后AGS細胞增殖

圖6 Western blotting檢測FAK/p-FAK相關(guān)蛋白表達

3 討論

Lumican 是SLRP 家族的重要成員，具有大約40 ku的小核心蛋白，擁有6～10個富含亮氨酸的重復(fù)單元，其中包含4個用于硫酸角蛋白/非硫酸乳糖胺聚糖鏈的N-糖基化位點，N端含有半胱氨酸/二硫基殘基和硫酸酪氨酸殘基，C 端含有2 個半胱氨酸殘基[8]。lumican 不僅是細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，而且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，目前認為其可與細胞外基質(zhì)其他物質(zhì)相互作用，在不同類型的癌組織中對增殖、侵襲和遷移可能起到重要作用[17]。Radwanska 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，lumican 可通過重構(gòu)肌動蛋白細胞骨架促進結(jié)腸癌細胞遷移。大量的研究表明lumican具有致癌和抑癌雙重作用[19]。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，癌細胞中的lumican 含有一種聚乳酸胺鏈，這些糖基化的lumican 可以促進癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中l(wèi)umican mRNA 表達水平明顯升高，而在正常組織中表達較低（P＜0.05）；上調(diào)lumican 表達，AGS 細胞侵襲、遷移和增殖能力明顯增強，而下調(diào)lumican表達則導(dǎo)致AGS細胞侵襲、遷移和增殖能力明顯減弱（P＜0.05）。Chen等[21]認為lumican可以作為一個獨立的胃癌預(yù)后情況的預(yù)測因素。多因素分析顯示，高表達lumican 是總體生存期較差胃癌的重要獨立預(yù)測因子，在高lumican 表達表型的樣品中，14條信號通路明顯富集[22]。這些研究均提示，lumican在胃癌的發(fā)展過程中可能是一種致癌基因，可作為胃癌潛在的預(yù)后指標和治療靶點。

從腫瘤生物學(xué)的角度來看，F(xiàn)AK 的激活導(dǎo)致Tyr397上FAK的自磷酸化，為Src同源性(SH2)含域蛋白創(chuàng)造了一個高親和力的結(jié)合位點。Src家族激酶結(jié)合在FAK 的phospho-Tyr397 上，通過在其他酪氨酸位點(包括FAK 的Tyr407、Tyr576、Tyr577 和Tyr925)進行額外的酪氨酸磷酸化，促進FAK激酶活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。Wang 等[14]進行的功能研究揭示整合素β1-FAK 信號通路介導(dǎo)Lumican 促進胃癌細胞增殖、遷移、和侵襲，Mao等[12]通過耗盡lumican失活MAPK 信號可抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移。Karamanou等[17]在研究侵襲性乳腺癌抗癌活性的分子機制時發(fā)現(xiàn)，lumican可下調(diào)整合素的下游信號通路如FAK、ERK 1/2 MAPK 42/44 和AKT 等。本研究中，干擾胃癌AGS 細胞的lumican 表達可引起FAK/p-FAK通路蛋白發(fā)生相應(yīng)改變，包括沉默AGS細胞中的lumican引起FAK/p-FAK相關(guān)蛋白表達下調(diào)，而過表達lumican 可引起FAK/p-FAK 相關(guān)蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），說明lumican 可激活FAK/p-FAK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胃癌AGS 細胞的侵襲、遷移及增殖過程中發(fā)揮重要作用。提示lumican 可能通過激活FAK/p-FAK 信號通路促進胃癌AGS 細胞的侵襲、遷移及增殖。至于FAK/p-FAK 的激活機制，是過量表達的lumican 促進胃癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附和遷移而激活FAK 通路，或是lumican 直接導(dǎo)致FAK 的酪氨酸發(fā)生磷酸化而激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，還有待進一步研究。

綜上，胃癌細胞lumican 表達增強，其高表達可促進胃癌細胞侵襲、遷移及增殖，并可能通過激活FAK/p-FAK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)。lumican 可能是潛在的胃癌分子診斷及預(yù)后標記物。