蔡濱，梁曉強，倪效，葉圳，李炯

胰腺纖維化嚴重威脅人類健康，其臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復出現(xiàn)的上腹痛、胰腺鈣化、脂肪變性、胰腺假性囊腫、胰腺的內(nèi)分泌和外分泌功能不足[1-2]。胰腺纖維化的特征是細胞外基質(zhì)增加，炎性細胞浸潤，腺泡細胞損傷和減少，腺管結(jié)構(gòu)變化及腺管中結(jié)石形成[3-4]。Wnt蛋白涉及19種高度保守，分泌富含半胱氨酸的糖蛋白家族，在調(diào)節(jié)各種生理過程中起著重要作用，包括細胞存活、增殖、遷移和極性、細胞命運和干細胞自我更新[5]。Wnt蛋白激活涉及至少4個不同的細胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)：Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Wnt/Ca2+、Wnt平面細胞極性和Wnt/蛋白激酶A(PKA)途徑。Wnt信號轉(zhuǎn)導的失調(diào)導致發(fā)育缺陷和人類疾病，影響組織發(fā)育或體內(nèi)平衡[6]。研究表明，Wnt/β-catenin信號傳導在多個器官，特別是肝臟的纖維化發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[7]。研究已經(jīng)證實，該途徑可通過上調(diào)Wnt和β-catenin蛋白水平并增加核β-catenin的表達來介導胰腺星狀細胞(多能性干細胞)的激活[8]。近期研究表明，大承氣湯具有抗炎作用，對重癥胰腺炎具有良好的治療效果[9]。然而，大承氣湯對胰腺纖維化是否有治療作用尚不清楚，本研究擬探討大承氣湯經(jīng)Wnt/β-catenin通路改善大鼠胰腺纖維化的作用機制，為胰腺纖維化的治療提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：SPF級SD大鼠購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，雌雄不限，10～12周齡，體質(zhì)量260～320 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2019-0019，動物使用許可證號：SYXK(蘇)2019-0058，動物質(zhì)量合格證號：M30617914。動物飼養(yǎng)環(huán)境為：(22±2)℃，濕度60%，12 h明/暗循環(huán)，自由飲水進食。(2)藥物及試劑：大承氣湯(組方：大黃12 g、芒硝12 g、厚樸12 g、枳實12 g，由醫(yī)院中藥房提供，藥材購自安徽百禾堂中藥飲片有限公司，加水煎煮2次，每次1 h，混合2次藥液過濾去渣，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成生藥量分別為0.6、1.2 g/ml的湯劑)；清胰利膽顆粒(吉林省撫松制藥股份有限公司)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉溶液(天津百倫斯生物科技有限公司)；蘇木精—伊紅(HE)染液、裂解緩沖液、二辛可寧酸蛋白測定試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增強的化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；淀粉酶、透明質(zhì)酸檢測試劑盒(美國貝克曼公司)；總RNA提取試劑盒(日本希森美康公司)；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；Wnt、β-catenin、GAPDH單克隆抗體、兔抗鼠二抗(美國Southern Biotech公司)。(3)儀器：AS-09型光學顯微鏡(日本尼康公司)；StepOne/StepOne Plus型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)；Healthcare型凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.2 實驗方法 2020年7—9月在上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院實驗室進行實驗。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗，參照文獻[10]的方法建立胰腺纖維化大鼠模型，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%的二乙基二硫代氨基甲酸鈉溶液700 mg/kg，間隔1日注射1次，共注射15次。通過胰腺組織HE染色觀察病理結(jié)構(gòu)，判斷模型建立的成功與否。53只大鼠參與造模，成功48只，將建模成功的大鼠隨機數(shù)字表法分為模型組、清胰利膽顆粒組(2.678 g/kg)、大承氣湯低劑量組(6 g/kg)、大承氣湯高劑量組(12 g/kg)[11-12]，每組12只；另取12只大鼠腹腔注射等量生理鹽水設(shè)為空白對照組。各藥物組給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg，空白對照組及模型組給予等體積的生理鹽水，每天1次，給藥周期為4周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 胰腺損傷指標測定：干預4周后，大鼠腹主動脈取血，8 000×g離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清淀粉酶、透明質(zhì)酸水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 胰腺組織形態(tài)學檢查：頸脫臼處死大鼠，鈍性分離胰腺組織，將胰腺組織在4%多聚甲醛中固定過夜，使用標準方法包埋在石蠟中，然后連續(xù)切片(4 μm厚)，用HE染液對組織進行染色，通過光學顯微鏡進行組織學檢查。對胰腺組織病理進行纖維化指數(shù)和腺體破壞指數(shù)評分[13]，評分范圍0～5分(0分為正常，5分為嚴重)，評分項目包括：炎性反應(yīng)、纖維化、纖維腺泡萎縮和細胞排列評分。

1.3.3 胰腺組織中Wnt、β-catenin mRNA水平測定：使用總RNA提取試劑盒提取胰腺組織總RNA，并使用cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行定量PCR反應(yīng)。所有PCR數(shù)據(jù)均針對管家基因GAPDH進行標準化，引物由北京安必奇生物科技有限公司合成，序列如下：Wnt正向5'-CAAAATGGTTCTCCCAAGGA-3'，Wnt反向5'-ACATCTTCTCGCCATTCCAC-3'；β-catenin正向5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3'，β-catenin反向5'-CAAGGCGTGTTCTGTCTCAA-3'；GAPDH正向5'-CACCCTTCTACTATCTCCTCCAT-3'，GAPDH反向5'-CGAGATCAGCTCAGCTGCAAGTC-3'。循環(huán)條件為50℃ 2 min，95℃ 1min，然后95℃ 40 s和60℃ 30 s的40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法確定相對mRNA表達水平。

1.3.4 胰腺組織中Wnt、β-catenin蛋白水平測定：獲取胰腺組織(40 mg)，然后用裂解緩沖液裂解，通過二辛可寧酸法測定蛋白質(zhì)濃度，通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出總細胞蛋白(20 μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜用5%脫脂奶在PBS緩沖液中室溫封閉2 h，并在4℃與Wnt、β-catenin、GAPDH一抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌3次后，將膜與兔抗鼠二抗(1∶5 000)在室溫下放置1 h孵育。使用增強的化學發(fā)光試劑盒將蛋白條帶可視化，凝膠成像系統(tǒng)對蛋白質(zhì)條帶進行捕獲和定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺纖維化指標比較 與空白對照組比較，模型組纖維化指數(shù)評分、腺體破壞指數(shù)評分及血清淀粉酶、透明質(zhì)酸水平升高(P<0.05)；與模型組比較，清胰利膽顆粒組及大承氣湯低、高劑量組纖維化指數(shù)評分、腺體破壞指數(shù)評分、血清淀粉酶、透明質(zhì)酸水平降低(P<0.05)；且大承氣湯高劑量組上述指標水平低于大承氣湯低劑量組(P<0.05)；清胰利膽顆粒組與大承氣湯高劑量組上述指標水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠胰腺纖維化指標的比較

2.2 各組大鼠胰腺病理結(jié)構(gòu)變化比較 空白對照組胰腺結(jié)構(gòu)正常；模型組胰腺出現(xiàn)導管增生，見大量纖維組織、空泡樣變、嗜酸性粒細胞浸潤明顯，且胰腺組織間隔增寬，脂肪組織代替部分壞死腺體組織；清胰利膽顆粒組及大承氣湯低、高劑量組胰腺組織纖維化程度減輕，炎性細胞、脂肪細胞浸潤減少，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理結(jié)構(gòu)變化比較(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，模型組胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，清胰利膽顆粒組及大承氣湯低、高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA水平降低(P<0.05)；且大承氣湯高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA水平低于大承氣湯低劑量組(P<0.05)；清胰利膽顆粒組與大承氣湯高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA水平比較

2.4 各組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，模型組胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，清胰利膽顆粒組及大承氣湯低、高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)；且大承氣湯高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白水平低于大承氣湯低劑量組(P<0.05)；清胰利膽顆粒組與大承氣湯高劑量組胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖2。

表3 各組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平比較

注：A.空白對照組;B.模型組;C.清胰利膽顆粒組;D.大承氣湯低劑量組;E.大承氣湯高劑量組

3 討 論

從中醫(yī)角度來講，胰腺纖維化是痰瘀凝滯之病[14]。胰腺纖維化是慢性胰腺炎的主要病理特征，中醫(yī)將慢性胰腺炎歸結(jié)為“腹痛、胃心痛、脅痛、泄瀉、瘕”等病癥范疇，多由外邪侵襲、情志失暢、飲食不節(jié)、恣食肥甘、蟲積內(nèi)積或創(chuàng)傷等導致肝膽不利，濕熱積滯中焦，中焦氣機不暢，日久則肝郁氣滯，痰瘀凝滯之。濕熱內(nèi)困，當以清熱化濕；肝旺乘脾，當以疏肝理氣；痰濕蘊脾，當以燥濕滌痰；氣滯血瘀，當以理氣活血；腑氣不通，當以通腑瀉下。大承氣湯方中大黃瀉熱通便，燥濕化痰，蕩滌腸胃，為君藥；芒硝助大黃瀉熱通便活血化瘀散結(jié)，并能軟堅潤燥，為臣藥，二藥相須為用，峻下熱結(jié)之力甚強；積滯內(nèi)阻，則腑氣不通，故以厚樸、枳實行氣散結(jié)，消痞除滿，并助硝、黃推蕩積滯以加速熱結(jié)之排泄，共為佐使[15]?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)，大承氣湯含有黃酮等活性物質(zhì)，進一步的藥理學研究表明，大承氣湯具有降低毛細血管通透性，減少炎性滲出物，降低炎性反應(yīng)病灶的擴散；減少內(nèi)毒素吸收，改善微循環(huán)，增加腹腔臟器的血流量，減輕組織缺血、缺氧狀態(tài)，具有抗炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)，抗病毒和抗腫瘤的作用[16-17]。本研究中，模型組纖維化指數(shù)評分、腺體破壞指數(shù)評分及血清淀粉酶、透明質(zhì)酸水平高于空白對照組；模型組胰腺出現(xiàn)導管增生，見大量纖維組織、空泡樣變、嗜酸性粒細胞浸潤明顯，且胰腺組織間隔增寬，脂肪組織代替部分壞死腺體組織，符合胰腺炎和胰腺纖維化的表現(xiàn)[18-20]。給予大承氣湯治療后，大承氣湯低、高劑量組纖維化指數(shù)評分、腺體破壞指數(shù)評分及血清淀粉酶、透明質(zhì)酸水平低于模型組，胰腺組織纖維化程度減輕，炎性反應(yīng)、脂肪細胞浸潤減少，且大承氣湯各劑量組之間呈劑量依賴性。說明大承氣湯對大鼠胰腺纖維化具有明顯改善作用。

Wnt是一種多能細胞因子，在調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)、細胞生長和分化中起著不可或缺的作用。有研究表明，肝硬化和心臟纖維化等疾病中Wnt高表達[21-22]。Wnt是促進多能性干細胞中纖維化反應(yīng)的促纖維化因子之一[23]。通過β-catenin蛋白廣泛表征的典型Wnt/β-catenin信號傳導可驅(qū)動特定靶基因的活化并調(diào)節(jié)一系列生物過程，在激活該信號通路的過程中，細胞質(zhì)β-catenin穩(wěn)定并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子特別是T細胞因子和淋巴增強因子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[24-25]。有研究證實，Wnt/β-catenin信號傳導途徑參與調(diào)節(jié)細胞分化和增殖[26]。Wnt/β-catenin信號通路激活與維甲酸誘導的纖連蛋白表達有關(guān)，并協(xié)同抑制纖連蛋白分解[27-28]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在體外刺激多能性干細胞時被激活，進而誘導多能性干細胞向纖維細胞轉(zhuǎn)化[29]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平高于空白對照組，給予大承氣湯治療后，大承氣湯低、高劑量組大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平低于模型組，大承氣湯各劑量組之間呈劑量依賴性。說明大承氣湯抑制大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白表達進而抑制Wnt/β-catenin通路激活，改善大鼠胰腺纖維化。

綜上所述，大承氣湯對大鼠胰腺纖維化具有明顯改善作用，其機制可能與大承氣湯抑制大鼠胰腺組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白表達進而抑制Wnt/β-catenin通路激活有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

蔡濱：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；梁曉強：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；倪效：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；葉圳：進行統(tǒng)計學分析；李炯：課題設(shè)計，論文撰寫