李 焰 岳 穩(wěn) 李 婷 潘佳佳 邱龍新* 黃 杰 李狀偉

(1.龍巖學院生命科學學院，龍巖 2364000；2.福建省生豬疫病防控工程技術研究中心，龍巖 2364000；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室，龍巖 2364000；4.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福州 2350000)

在規(guī)?；B(yǎng)豬生產中，各種病原菌及其毒素侵襲，甚至是病原菌的感染、創(chuàng)傷都會使仔豬處于應激狀態(tài)，嚴重時會產生高燒、腹瀉、采食量下降等癥狀，造成仔豬生長受阻，生長性能下降。目前對仔豬應激的防治措施很多，遵循中藥配伍的相須、相使原則，不斷開發(fā)新的復方中藥免疫增強劑進行調控是一條行之有效的解決途徑。例如，陳燕凌等研制的復方中藥制劑可在一定程度上改善斷乳仔豬的生長性能，預防腹瀉；陳張華等報道，在斷奶仔豬飼糧中添加1.0%“豬康散”能增強仔豬細胞免疫功能和提高仔豬生長性能；程佳等研究證實，中藥制劑柴術抗激散對LPS導致的早期斷奶仔豬免疫應激具有明顯的緩減作用。以上研究表明，復方中草藥制劑將成為理想的免疫調節(jié)劑應用于養(yǎng)豬生產。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.2%復方銀杏葉制劑有助于提高愛拔益加(AA)肉仔雞的生長性能和免疫功能；飼糧中添加1.00%的復方銀杏葉制劑可維持和養(yǎng)護斷奶肉兔的小腸黏膜組織；復方銀杏葉制劑還可維持和修復由免疫應激引起的斷奶仔豬腸道損傷，并能增強腸道黏膜的免疫功能。為進一步探究復方銀杏葉的作用機理，本試驗采用超高效液相色譜和四極桿飛行時間質譜(UHPLC-QTOF-MS)技術，研究LPS免疫應激仔豬的血清代謝組學特征及復方銀杏葉的干預效果，尋找其干預免疫應激仔豬的靶點及代謝通路，為復方銀杏葉免疫增強劑在仔豬上的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復方銀杏葉制劑組成及制備

復方銀杏葉由銀杏葉、黃芪、黨參、白術、茯苓、砂仁和陳皮按照10∶15∶15∶12∶15∶6∶9比例組成，藥物制備方法參照本課題組前期研究，每毫升藥液含1 g生藥(按照生藥量計算)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩；旌虾蟮膹头姐y杏葉制劑送至青島科標檢測研究院進行主要活性成分含量檢測。經檢測，試驗所用復方銀杏葉制劑中：總多糖含量7.60%，總黃酮含量0.06%，總皂苷含量1.70%，總黃酮醇苷含量1 647.97 mg/kg，萜類內酯含量650 mg/kg，黃芪甲苷含量95 mg/kg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量174.49 mg/kg，橙皮苷含量2 121.42 mg/kg。

1.2 試驗設計及樣品采集

試驗選取平均體重為(9.52±0.80) kg、(35±1)日齡的“杜×長×大”雜交仔豬36頭，按體重、胎次等一致原則隨機分為3組，每組4個重復，每個重復3頭。3組仔豬飼喂同一基礎飼糧，基礎飼糧參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。其中對照組每頭每天灌服110 mL生理鹽水，LPS應激組每頭每天灌服110 mL生理鹽水，LPS+復方銀杏葉組每頭每天灌服110 mL復方銀杏葉制劑。免疫應激模型的建立和樣品采集參照文獻的方法進行，即在正式試驗第23天LPS應激組和LPS+復方銀杏葉組仔豬腹膜注射LPS(大腸桿菌血清型O55∶B5，Sigma公司)，注射劑量為100 μg/kg，對照組仔豬腹膜注射等量的生理鹽水；注射LPS后3 h，所有豬只空腹前腔靜脈采血，3 000 r/min、4 ℃離心10 min制備血清，-80 ℃保存。試驗于龍巖學院動物房進行，采用半開放豬舍，自然通風，保持干燥，自由采食和飲水，消毒、免疫和管理按豬場常規(guī)程序進行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能測定

試驗期每天記錄每個重復豬的采食量，并分別在試驗第1、7、21、23和27天對所有試驗豬進行稱重(空腹12 h)，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 血清生化指標測定

采用邁瑞B(yǎng)S-420全自動生化儀測定血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)含量以及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GGT)和堿性磷酸酶(ALP)活性，以上指標均采用試劑盒(購自中生北控生物科技股份有限公司)測定，按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和LSD法多重比較，統(tǒng)計結果用平均值和標準誤(SE)表示，以P<0.05表示差異顯著。

1.4 血清代謝組學特征分析

1.4.1 代謝組學色譜和質譜條件

采用1290 UHPLC超高效液相色譜儀進行物質分離，在AB 6600 Triple TOF質譜儀下基于IDA采集模式進行一級、二級質譜數(shù)據(jù)的采集。采集條件如下：轟擊能量為30 ev，每50 ms采集15張二級譜圖。電噴霧離子源(ESI)參數(shù)設置如下：霧化氣壓(GS1)、輔助氣壓及氣簾氣壓分別為60、60和35 Psi；溫度為650 ℃，噴霧電壓為5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負離子模式)。

1.4.2 代謝組學血清樣品處理

將存放于-80 ℃的血清樣品復融后吸取100 μL至EP管中，加入300 μL甲醇，再加入20 μL內標，渦旋混勻30 s，超聲10 min(冰水浴)，-20 ℃靜置1 h， 4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液備用。

1.4.3 代謝組學數(shù)據(jù)處理與生物標志物鑒定

首先使用ProteoWizard軟件將原始質譜轉成mzXML格式，再使用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，并使用二級質譜數(shù)據(jù)庫對峰進行物質鑒定。

1.4.4 代謝組學統(tǒng)計分析及通路分析

將上述得到的化合物信息導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，將篩選出的差異化合物導入KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，注釋到差異代謝物相關的代謝通路，最后通過MetaboAnalyst網站進行通路富集。

2 結果與分析

2.1 復方銀杏葉對免疫應激仔豬生長性能的影響

由表2可知，在第23天之前，3個試驗組間的ADFI、ADG和F/G差異均不顯著(P>0.05)。在試驗第24～27天，LPS應激組的ADFI較對照組和LPS+復方銀杏葉組分別降低了21.52%和15.07%(P<0.05)，LPS應激組的ADG較對照組降低了51.22%(P<0.05)，LPS+復方銀杏葉組的ADG雖然較對照組降低了21.95%(P>0.05)，但較LPS應激組提高了60%(P>0.05)；在試驗第24～27天，LPS+復方銀杏葉組的F/G較LPS應激組降低了35.77%(P<0.05)，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明復方銀杏葉制劑可促進免疫應激仔豬的生長，提高飼料利用率。

表2 復方銀杏葉對免疫應激仔豬生長性能的影響

2.2 復方銀杏葉對免疫應激仔豬血清生化指標的影響

由表3可知，注射LPS后，與對照組相比，LPS應激組血清γ-GGT、ALT和ALP活性以及UN、CREA含量均顯著升高(P<0.05)，GLP-2含量則顯著降低(P<0.05)；與LPS應激組相比，復方銀杏葉顯著緩解了LPS刺激引起的血清UN、CREA含量和γ-GGT活性的升高(P<0.05)，以及LPS刺激引起的血清GLP-2含量降低(P<0.05)。

表3 復方銀杏葉對免疫應激仔豬血清生化指標的影響

2.3 代謝組學的多元統(tǒng)計分析

3組血清樣品及QC樣本PCA見圖1。在正、負2種離子模式下，對照組與LPS+復方銀杏葉組和LPS應激組分離明顯，而LPS+復方銀杏葉組與對照組和LPS應激組之間存在交叉。在正離子模式下，74.1%樣本符合模型判別(R2X=0.741)，模型的預測能力66.9%(Q2=0.669)；在負離子模式下，R2X=0.668、Q2=0.534，表明在2種離子模式下模型擬合均良好。為了篩選得到由組間差異而形成的潛在標志物，減少干擾因素對相似性聚類分析的影響，在LPS應激模型基礎上，使用有監(jiān)督的模式識別方法正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DAS)進一步區(qū)分LPS+復方銀杏葉組與LPS應激組的血清代謝模式的變化，如圖2所示。在負離子模式下，R2X=0.284，R2Y=0.851，Q2=-0.430；在正離子模式下R2X=0.268，R2Y=0.828，Q2=-0.272。

K：對照組 control group； M：LPS應激組LPS-stressed group；S： LPS+復方銀杏葉組 LPS+GBC group； QC：質控樣本 quality control sample。圖2同 the same as Fig.2.

圖2 OPLS-DA模型得分散點圖(LPS+復方銀杏葉組vs.LPS應激組)

2.4 代謝組學生物標志物篩選

根據(jù)UHPLC-QTOF-MS所得數(shù)據(jù)，利用SIMCA14.1軟件在建立OPLS-DA模型基礎上，通過S-plot分析指標篩選LPS+復方銀杏葉組與LPS應激組之間的差異變量作為潛在的生物標志物(P<0.05且VIP>1)。如圖3中紅色標記，這些差異變量可能是LPS+復方銀杏葉組與LPS應激組的關鍵代謝物。在正、負2種離子模式下，分別檢測到831(正離子模式)、834(負離子模式)種物質，通過比對數(shù)據(jù)庫，鑒定出得分值高于0.6分的化合物作為內源性生物標志物，正離子模式下定性到141個，負離子模式下定性到118個。使用SIMCA14.1軟件進行多元變量分析，在正離子模式下，共篩選出2個內源性生物標志物；在負離子模式下，共篩選出5個內源性生物標志物。將正、負離子的所有標志物結合在一起，通過KEGG通路分析，進一步篩選得到有KEGG號的7個生物標志物，見表4。

圖3 S-plot(LPS+復方銀杏葉組vs.LPS應激組)

由表4可見，在正離子模式下，共篩選出2個內源性生物標志物，分別是L-焦谷氨酸、N6-甲基-L-賴氨酸；在負離子模式下，共篩選出5個內源性生物標志物，分別是羥(基)脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、棕櫚酸和甘氨石膽酸。與LPS應激組相比，LPS+復方銀杏葉組血清N6-甲基-L-賴氨酸和L-谷氨酸含量顯著上升(P<0.05)，血清L-焦谷氨酸、羥(基)脯氨酸、左旋谷氨酰胺、棕櫚酸和甘氨石膽酸含量顯著下降(P<0.05)。

表4 主要差異代謝物(LPS+復方銀杏葉組vs. LPS應激組)

2.5 代謝通路分析

將上述篩選的有KEGG號的7個內源性生物標志物導入MetaboAnalyst網站進行富集通路分析，篩選得到12個代謝通路，見圖4。將潛在的靶標路徑臨界值設置為0.25，得到2個代謝通路，分別是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。

圖4 用MetaboAnalyst軟件進行富集通路分析結果

3 討 論

3.1 免疫應激仔豬生長性能、血清生化指標的變化以及復方銀杏葉干預的效果

目前腹腔注射一定劑量的LPS是模擬免疫應激最典型的方式之一。LPS是革蘭氏陰性菌的重要組分多糖，能誘導機體發(fā)生強烈的應激，導致動物精神不振、發(fā)熱、采食量下降。本試驗臨床效果顯示，第23天注射LPS后，仔豬出現(xiàn)精神沉郁、嘔吐、畏寒成堆躺臥、腹瀉、體溫升高至40.5 ℃左右。已有報道證實，LPS應激可造成仔豬生長性能顯著降低[9-10]，本試驗結果與上述報道一致，不僅說明本次試驗用LPS制作免疫應激模型是成功的，也證實用復方銀杏葉制劑干預后可促進免疫應激仔豬生長，提高飼料利用率。

血液ALT、AST和ALP是反映肝臟功能的重要指標，三者活性的升高不僅表示肝臟受到嚴重損傷，也是機體受到應激反應的標志[11]；血清中γ-GGT主要來自肝膽系統(tǒng)，當肝臟內合成亢進或膽汁排出受阻時，血清γ-GGT活性增高[12]。本試驗中，LPS應激組血清中的ALT、ALP、γ-GGT活性較對照組均顯著升高，說明免疫應激造成仔豬肝功能受損。GLP-2是一種腸道多肽類激素，具有多種腸道效應，包括刺激腸黏膜生長、促進營養(yǎng)物的消化和吸收、提高腸屏障功能、抑制胃能動性和胃酸分泌等[13-14]。本試驗發(fā)現(xiàn)LPS應激組血清中GLP-2含量較對照組顯著降低，說明免疫應激還造成了仔豬腸道屏障功能受損，與車煉強等[15]報道一致。而用復方銀杏葉干預免疫應激仔豬后，LPS+復方銀杏葉組血清ALT、AST、ALP、γ-GGT活性及ALT/AST較LPS應激組均有所下降，血清GLP-2含量較LPS應激組顯著提高，說明復方銀杏葉可緩解免疫應激導致的仔豬肝臟和腸道屏障功能的損傷。血液中的UN和CREA是蛋白質代謝的主要產物，蛋白質代謝良好時，血液中這些非蛋白氮的含量會降低[16]。本試驗中，LPS+復方銀杏葉組血清中UN和CREA含量顯著低于LPS應激組，這與ADG的變化趨勢相一致，說明復方銀杏葉是通過提高GLP-2含量、降低仔豬血清中非蛋白氮含量，在一定程度上改善了免疫應激仔豬對營養(yǎng)物質的消化和吸收。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復方銀杏葉通過調控細胞因子生成，能有效拮抗環(huán)磷酰胺對肝臟和脾臟組織造成的損傷[17]，還有修復脾虛性斷奶仔豬小腸組織的作用[18]。因此，可將復方銀杏葉開發(fā)成一種理想的免疫調節(jié)劑。

3.2 基于血清代謝組學的復方銀杏葉干預免疫應激仔豬的作用機制研究

本研究基于LPS誘導建立的免疫應激模型，將LPS應激組與LPS+復方銀杏葉組進行比較，PCA得分圖顯示，LPS應激組血清代謝物與對照組分離明顯，說明LPS應激后仔豬的生理代謝環(huán)境受到明顯干擾，病理狀態(tài)下代謝網絡出現(xiàn)紊亂；正、負離子模式下LPS+復方銀杏葉組血清代謝物與對照組均有少許重疊，與LPS應激組之間存在交叉，但負離子模式下LPS+復方銀杏葉組和LPS應激組之間區(qū)分較明顯，綜合OPLS-DA說明復方銀杏葉干預LPS免疫應激仔豬后，雖不能完全逆轉病理到正常狀態(tài)，但顯示已經發(fā)揮一定的藥效作用，提示復方銀杏葉制劑在干預LPS免疫應激仔豬的應用方面在使用劑量、劑型或者時間上還有改進空間。

通過差異代謝物分析，與LPS應激組相比，LPS+復方銀杏葉組血清N6-甲基-L-賴氨酸和L-谷氨酸含量顯著上升，血清L-焦谷氨酸、羥(基)脯氨酸、左旋谷氨酰胺、棕櫚酸和甘氨石膽酸含量顯著下降。谷氨酸作為一種功能性氨基酸，是腸上皮的主要能源物質[19]，不僅參與蛋白質的合成和氧化供能[20]，還具有改善腸道上皮完整性、增強腸道屏障功能和抗氧化能力、提高腸道干細胞的活性和促進腸道發(fā)育的作用[21-24]；賴氨酸作為第一限制性氨基酸，參與豬體內蛋白質、脂肪代謝以及肉毒堿的形成等，還有利于鈣的吸收，有助于抗體、激素、酶等的形成，增強機體免疫力[25-26]；雖然谷氨酰胺和谷氨酸一樣具有為腸上皮細胞提供能量的功能，并且還能增加腸道對亮氨酸和脯氨酸的吸收量[27]，但是當谷氨酸和谷氨酰胺同時存在時，腸上皮細胞會優(yōu)先利用谷氨酸，從而抑制谷氨酰胺氧化供能[28]，故推測LPS+復方銀杏葉組谷氨酰胺、脯氨酸的代謝產物羥(基)脯氨酸和焦谷氨酸含量較LPS應激組顯著下降與其血清中谷氨酸含量顯著增加有關，由此也降低了由谷氨酰胺轉化為有害的焦谷氨酸的缺陷。肝細胞代謝障礙時會致使血液中膽汁酸含量升高[29]。差異代謝物分析結果顯示，LPS+復方銀杏葉組血清甘氨石膽酸含量較LPS應激組顯著下降，進一步說明復方銀杏葉可緩解LPS應激導致的肝臟損傷。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，復方銀杏葉對預防免疫應激仔豬藥效作用的靶標代謝通路主要為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，涉及到機體內碳水化合物、氨基酸、脂類等物質代謝。本試驗盡管已經初步篩選出復方銀杏葉緩解仔豬免疫應激相關的生物標志物，但是仍需要進一步通過試驗和臨床驗證。

4 結 論

① 復方銀杏葉可顯著緩解LPS應激導致的仔豬血清生化指標的改變，減輕肝臟損傷，改善仔豬對營養(yǎng)物的消化和吸收，提高機體對含氮物質的利用效率以及腸黏膜屏障功能，從而保證仔豬的正常生長發(fā)育，提高飼料利用率。

② 復方銀杏葉預防仔豬LPS應激、提高生產性能的藥效作用的靶標代謝通路主要為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。