李 淑 劉永需 張玉娟 趙 紅 楊國(guó)雨 劉公言 劉 磊 李福昌*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 2271018；2.青島康大食品有限公司，青島 2266555；3.山東省康復(fù)醫(yī)院，濟(jì)南 2250109；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 2250100)

飼糧中添加鋅能夠有效提高生長(zhǎng)期獺兔的生長(zhǎng)性能和鋅相關(guān)酶活性，有利于提高獺兔機(jī)體免疫力[1]。鋅與脂肪代謝有密切關(guān)系，鋅的攝入過多或過少均能干擾脂類代謝，引起血脂異常，影響肝臟膽固醇含量，增加氧化應(yīng)激[2]。脂肪代謝分為合成代謝和分解代謝，其過程受到眾多酶和因子的調(diào)控。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)、脂肪酸合成酶(FAS)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是在脂肪酸氧化和合成過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵酶[3]。激素敏感脂酶(HSL)、脂蛋白脂酶(LPL)是動(dòng)物體脂肪分解的關(guān)鍵酶[4]。脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的結(jié)合、攝取和運(yùn)輸?shù)冗^程[5]。鋅可以誘導(dǎo)具有清除自由基和抗氧化作用的不同金屬硫蛋白的合成，從而對(duì)脂肪酸的過氧化提供有效保護(hù)[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的鋅能夠改善高脂血癥大鼠的脂肪代謝，并降低血清脂聯(lián)素的含量[7]；飼糧中添加鋅能夠提升仔豬的消化機(jī)能，而缺鋅導(dǎo)致仔豬發(fā)育遲緩[8]。已有研究表明，肥胖的機(jī)體中血清鋅和鋅指蛋白的含量較低，且編碼該蛋白的基因表達(dá)量也低[9]。細(xì)胞鋅狀態(tài)的變化會(huì)影響多種轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARγ，在脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝中起著重要作用[10]，而PPARγ激活了大量與儲(chǔ)存脂質(zhì)生物合成和降解相關(guān)的基因[11]。據(jù)報(bào)道，如果飲食中鋅含量增加到推薦膳食容許量(RDA)的2倍，健康兒童體內(nèi)的脂肪含量會(huì)增加，這是因?yàn)殇\促進(jìn)脂肪沉積，增加了脂肪細(xì)胞的數(shù)量[12]。動(dòng)物缺鋅時(shí)會(huì)刺激葡萄糖在肌肉和脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，機(jī)體對(duì)葡萄糖的處理能力下降，導(dǎo)致脂肪分解代謝增加，食欲變差[13-14]。鋅的減少導(dǎo)致鐵超載，從而直接激活了硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的轉(zhuǎn)化活性，以促進(jìn)脂質(zhì)生物合成和積累[15]。補(bǔ)充鋅會(huì)使脂肪代謝中甘油三酯、低密度脂蛋白的含量下降，高密度脂蛋白的含量升高[16]。肝臟是外源性和內(nèi)源性脂肪代謝途徑的交匯點(diǎn)及調(diào)節(jié)中心[17]，在一些研究中，缺鋅會(huì)加劇肝臟脂肪代謝，而補(bǔ)充鋅則會(huì)增加肝細(xì)胞活性，改善肝臟脂肪代謝[18]。吳文杰[19]的研究顯示，添加外源性硫酸鋅不僅改善了糖尿病模型大鼠肝臟的病理損傷，還改善了其過氧化狀態(tài)及脂肪代謝紊亂。相反，Weigand等[20]的研究則表明中度缺鋅不改變高脂飲食大鼠肝臟脂肪含量和脂肪酸組成。綜上可知，鋅會(huì)影響動(dòng)物機(jī)體的脂肪代謝，但具體影響機(jī)制還不明確。鑒于此，本試驗(yàn)以生長(zhǎng)獺兔為研究對(duì)象，研究飼糧中添加鋅對(duì)其脂肪沉積以及脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探索鋅參與脂肪代謝的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)的兔營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和李福昌[21]推薦的家兔營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加0、40、80和120 mg/kg的鋅(硫酸鋅形式)，配制4種試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)飼糧中鋅含量的實(shí)測(cè)值分別為9.7、49.4、87.0和127.4 mg/kg。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選用160只3月齡、平均體重(1 908±105) g、健康狀況良好的生長(zhǎng)獺兔，按體重隨機(jī)分成4組，每組40只，每只為1個(gè)重復(fù)。4組獺兔分別飼喂添加0(對(duì)照組)、40、80和120 mg/kg鋅(硫酸鋅形式)的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)前進(jìn)行徹底全面清潔消毒，試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)過程中采用常規(guī)飼養(yǎng)管理程序，保持自然采光和通風(fēng)，3～5 d消毒兔舍1次。預(yù)試期7 d，正試期49 d。試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)取8只試驗(yàn)兔，采用頸椎錯(cuò)位法致死后屠宰，將肩胛脂肪、腎周脂肪剝離并稱重，并采集樣品放于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃保存，用于脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定。

1.3 脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定

采用Trizol法提取脂肪組織樣品總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和核酸分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA

的質(zhì)量和濃度。按照TaKaRa RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后按照Roche熒光定量試劑盒操作，在美國(guó)AB7500系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。參照Livak等[22]的方法，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法定量目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因的引物序列見表2。

表2 相關(guān)基因的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件進(jìn)行方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值和均方根誤差(R-MSE)表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔脂肪沉積的影響

由表3可知，飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪沉積量沒有顯著影響(P>0.05)，但有降低腎周脂肪沉積量的趨勢(shì)(P=0.095 3)。

表3 飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔脂肪沉積的影響

2.2 飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪中脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1顯示，飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪中PPARγ、FATP、FAS、ACCmRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，添加40 mg/kg鋅組肩胛脂肪中FABPmRNA相對(duì)表達(dá)量的顯著增加(P<0.05)，LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；添加120 mg/kg鋅組肩胛脂肪中FABP、CPT1、HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。此外，添加120 mg/kg鋅組肩胛脂肪中PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于添加40 mg/kg鋅組(P<0.05)，F(xiàn)ABP、CPT1、HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于添加80 mg/kg鋅組(P<0.05)；添加80 mg/kg鋅組肩胛脂肪中LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于添加40 mg/kg鋅組(P<0.05)。

PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ；FATP：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；FABP：脂肪酸結(jié)合蛋白；CPT1：肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1；FAS：脂肪酸合成酶；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；HSL：激素敏感脂酶；LPL：脂蛋白脂酶。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.3 飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔腎周脂肪中脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖2顯示，飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔腎周脂肪中PPARα、PPARγ、FATP、FABP、FAS、ACCmRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，添加80 mg/kg鋅組腎周脂肪中HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；添加120 mg/kg鋅組腎周脂肪中CPT1、HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖2 飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔腎周脂肪中脂肪代謝相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，膳食中補(bǔ)充高鋅后顯著降低了成年男性血液中高密度脂蛋白含量[23]。鋅通過多種途徑激活在脂肪代謝中發(fā)揮著重要調(diào)控作用的細(xì)胞自噬和脂噬，緩解黃顙魚肝細(xì)胞中脂肪沉積，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)[24]。矛尾復(fù)蝦虎魚經(jīng)水體鋅暴露后，促進(jìn)了脂肪分解，抑制了脂肪合成，從而減少了肝臟脂肪沉積[25]。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加鋅有使腎周脂肪沉積量降低的趨勢(shì)，與上述研究結(jié)果相類似，說明鋅的添加能降低機(jī)體中脂肪的沉積。

脂肪代謝的主要途徑是線粒體脂肪酸β氧化，在此過程中游離脂肪酸與輔酶A酯化，進(jìn)入線粒體基質(zhì)，氧化生成乙酰輔酶羧化酶[26]。CPT1、酰基肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)酶和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶2(CPT2)這3種蛋白組成的肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶(CPT)系統(tǒng)介導(dǎo)長(zhǎng)鏈?；o酶A酯向線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。CPT1錨定在線粒體外膜上，負(fù)責(zé)將酰基輔酶A轉(zhuǎn)化為?；鈮A，通過轉(zhuǎn)運(yùn)酶穿過線粒體膜，進(jìn)入β氧化之前在線粒體內(nèi)由CPT2將?；鈮A再轉(zhuǎn)換成?；o酶A[28]。CPT1被認(rèn)為是脂肪酸β氧化的限速酶，它被脂肪生成的第1個(gè)中間體丙二酰輔酶A抑制，作為維持脂肪酸代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制[29]。HSL是脂肪分解代謝過程中的限速酶，其作用是將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，為機(jī)體供能[30]。研究表明，F(xiàn)AS與HSL表達(dá)量的比值與肌肉脂肪含量高低呈顯著的正相關(guān)[31]。LPL是肌內(nèi)脂肪形成和沉積的標(biāo)志性蛋白，屬于脂肪酶超家族，是脂肪細(xì)胞分化的一個(gè)早期標(biāo)志物，在控制脂肪沉積上發(fā)揮核心作用，它直接調(diào)控所在組織的脂質(zhì)底物配額相對(duì)量，決定了脂肪代謝的方向，影響機(jī)體脂質(zhì)狀況及畜類的肉品質(zhì)[32]。

有研究報(bào)道，補(bǔ)充硫酸鋅后小鼠主動(dòng)脈中PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，這說明補(bǔ)鋅可能通過上調(diào)血管中PPARα的表達(dá)來增加脂肪酸氧化，進(jìn)而減少甘油三酯的產(chǎn)生[33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加120 mg/kg鋅上調(diào)了生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪和腎周脂肪中PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量。研究顯示，飼糧中添加鋅顯著提高了肉雞肝臟中FAS和LPL的活性和腹脂中LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量[34-35]；鋅暴露上調(diào)了黃顙魚肝臟中CPT1的表達(dá)，下調(diào)了肌肉中CPT1的表達(dá)[36]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加不同水平鋅對(duì)生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪和腎周脂肪中FAS的表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響，下調(diào)了LPL的表達(dá)，上調(diào)了CPT1的表達(dá)，與前人研究結(jié)果不一致，這可能是由于不同物種、不同組織之間，脂肪酸的氧化分解能力具有不同的特異性。據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，參與脂肪合成的FAS基因可能不是鋅起作用的靶基因。本試驗(yàn)中，飼糧中添加120 mg/kg鋅使生長(zhǎng)獺兔肩胛脂肪和腎周脂肪中HSL的表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)AS與HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量的比值下降，說明脂肪分解增加，從而使得脂肪沉積減少。

4 結(jié) 論

飼糧中添加120 mg/kg鋅(硫酸鋅形式)上調(diào)了生長(zhǎng)獺兔脂肪分解過程中相關(guān)基因的表達(dá)，增加了脂肪分解和脂肪酸氧化進(jìn)程，從而使脂肪沉積有降低的趨勢(shì)。