余曼榮 賀建華 肖定福

(湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 2410128)

炎癥性腸病(IBD)是一種慢性胃腸道自身免疫性疾病，潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)是IBD的2種主要形式[1-4]。UC的發(fā)病部位局限于黏膜并持續(xù)影響直腸和結腸[5]；CD的典型特征是腸道的透壁炎癥，并可能影響從口腔到肛周區(qū)域的胃腸道的任何部分[6]。近年來的研究表明，輔助性T細胞17(Th17)/調節(jié)性T細胞(Treg)平衡作為機體免疫調節(jié)網絡的重要部分，可以對IBD進行免疫調節(jié)。并且由于Th17/Treg平衡與眾多細胞因子和轉錄因子相互影響，這些細胞因子與轉錄因子組成的信號通路也可以間接對IBD產生調控作用。參考前人研究，本文綜合闡述了Th17/Treg平衡軸的分化形成、IBD的發(fā)病機制及其對動物生產的危害性、Th17/Treg平衡的信號通路以及基于Th17/Treg平衡開發(fā)飼料添加劑治療IBD等方面的內容，以期為Th17/Treg平衡應用于畜禽生產中IBD的預防和治療等方面提供科學依據(jù)，同時為“替抗”添加劑的使用與開發(fā)奠定理論基礎。

1 IBD概述

1.1 IBD的發(fā)病機理

IBD通常由易感基因、環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間復雜的一系列相互作用引起[7]。IBD的發(fā)病原因包括腸黏膜缺血及再灌注損傷、腸道菌群失衡、腸黏膜的失用性損傷和細胞因子致腸屏障損傷等[8]。遺傳和環(huán)境因素都參與了疾病過程[9]。IBD的發(fā)病過程涉及先天性和適應性免疫系統(tǒng)功能障礙[10]，多種炎性細胞因子的過度表達，效應器T細胞反應過度和調節(jié)性T細胞功能受損[11]等，許多細胞信號通路被認為參與了IBD的過程[12]。Th17細胞有助于炎癥的誘導和傳播，Treg則負責維持自身耐受性，從而抑制自身免疫[13]。因此，Th17細胞和Treg細胞之間的平衡被認為是治療自身免疫性疾病的重要靶點。在多種自身免疫性疾病的報道[14-18]中顯示，Th17/Treg平衡朝著促炎的Th17一側轉移，導致自身免疫性疾病的惡化[19]，這印證了Th17/Treg平衡失衡的致病性。

1.2 IBD對動物生產的危害

畜禽腹瀉是養(yǎng)殖場最常見的疾病之一，細菌、寄生蟲和營養(yǎng)不良等造成的長期腹瀉常并發(fā)或繼發(fā)IBD[20]。研究報道，10～30日齡仔豬極易罹患遲發(fā)性腹瀉病，俗稱仔豬白痢[21]。該病流行面廣，發(fā)病率與死淘率居高不下，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失[22]。在腹瀉過程中，豬的腸道上皮生理功能發(fā)生變化，白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)等炎癥因子水平隨之發(fā)生改變，影響腸道消化吸收功能[23]。牛的IBD多發(fā)于1～2周齡犢牛，常見體溫升高、下痢、糞便異常和腹痛等病征，且病犢恢復緩慢、發(fā)育遲緩，可能并發(fā)其他炎癥[24]。IBD可以發(fā)生于2～24周齡的雞，發(fā)病率高達50%，表現(xiàn)出各種不同程度的腸道組織病變及下痢、消瘦、體虛等癥狀[25]。發(fā)生壞死性腸炎(NE)時，雞腸道黏膜發(fā)生慢性損傷，影響雞的采食量和體重[26]。這是導致料重比升高、飼料轉化率降低和糞便富營養(yǎng)化等問題的原因。據(jù)報道，發(fā)生嚴重NE的雞群收益僅占無NE雞群收益的67%[27]。由此可見，IBD易導致發(fā)病動物腸道損傷、腹瀉和發(fā)育遲緩，病情嚴重還可能致死，對動物福利、經濟效益及環(huán)境保護都產生不利影響，嚴重危害動物生產行業(yè)。

2 Th17/Treg平衡

白細胞分化抗原4陽性輔助T細胞(CD4+T)在啟動和維持由多種微生物病原體引發(fā)的保護機體免疫反應中起著核心作用。在微環(huán)境中不同細胞因子的影響下，幼稚CD4+T可被活化并分化為幾個高度專業(yè)化的輔助細胞(Th)子集。到目前為止，一共有7種Th的亞群已被發(fā)現(xiàn)，分別是輔助性T細胞1(Th1)、輔助性T細胞2(Th2)、輔助性T細胞9(Th9)、輔助性T細胞22(Th22)、濾泡性輔助T細胞(Tfh)、Th17和Treg[28]。其中，Th17的譜系定義因子為維甲酸相關孤核受體γt/α(RORγt/α)，RORγt及其同種型RORγ由稱為Rorg(也被稱為Rorc)的單個基因編碼[29]；Treg的譜系定義因子為叉頭框蛋白3(Foxp3)，二者分別與信號傳導與轉錄激活因子(STAT)3和STAT5組成“兩因子”模型，分別驅動Th17和Treg的分化[30]。參與Th17發(fā)育的因子主要包括：分化因子如轉化生長因子-β(TGF-β)、IL-6、白細胞介素-21(IL-21)[31]，生長和穩(wěn)定因子如白細胞介素-23(IL-23)，轉錄因子如STAT3以及RORγt/α[32]。Th17可以通過衍生細胞因子白細胞介素-17A(IL-17A)、白細胞介素-17F(IL-17F)、IL-21和白細胞介素-22(IL-22)等刺激廣泛的組織反應，從而保護機體免受細胞外細菌和真菌感染[13]。Treg根據(jù)其來源分為2個不同的子集，天然發(fā)生的調節(jié)性T細胞(nTreg)源自胸腺細胞，而外周誘導型調節(jié)性T細胞(pTreg)則來自于受TGF-β刺激的CD4+T[33]，也有學者表示pTreg的產生似乎并不需要TGF-β刺激[33]。nTreg可以對白細胞介素-2(IL-2)產生應答，并通過STAT5發(fā)出信號，促進Foxp3表達并分化為Treg，產生抗炎因子，抑制炎性反應[34-35]。nTreg可確保自我耐受的控制，目前用于臨床試驗中以減輕造血干細胞移植后的自身免疫性疾病和移植物抗宿主病[36]。CD4+T在體內受各種信號刺激產生外周誘導性調節(jié)性T細胞(iTreg)，該細胞由外周成熟的T淋巴細胞亞群CD4+CD25-T在特異性抗原刺激下分化而成，可分泌大量IL-10[37]，但其具體轉化過程、穩(wěn)定性及抑制功能目前均沒有明確定義[38]。

3 介于Th17/Treg平衡調控IBD的相關信號通路

目前已有大量研究表明，通過調節(jié)Th17/Treg平衡可以調控IBD，該平衡又通過其上、下游各種細胞因子和轉錄因子組成的信號通路形成免疫調節(jié)網絡。以下介紹幾種常見的信號通路，其相關性如圖1所示。

IBD：炎癥性腸病 inflammatory bowel disease；IFN-γ：干擾素-γ interferon-γ；IL-1β：白細胞介素-1β interleukin-1β；IL-6R：白細胞介素-6受體 interleukin-6 receptor；IRAK1/2：IL-1受體相關激酶1/2 interleukin-1 receptor-associated kinase；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation factor 88；TLR：Toll樣受體 Toll-like receptor；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關因子6 tumor necrosis factor receptor-associated factor 6； NF-κB：核因子-κB nuclear factor-κB；p50/p65：NF-κB的亞單位 NF-κB subunit；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸酯 phosphatidylinositol diphosphate；PIP3：磷脂酰肌醇三磷酸酯 phosphatidylinositol triphosphate；PI3K：磷酸肌醇3激酶 phosphoinositide 3-kinase；STAT3：信號傳導及轉錄激活因子3 signal transducers and activators of transcription 3；RORγt：維甲酸相關核孤兒受體γt retinoic acid related nuclear orphan receptor γt；gp130：糖蛋白130 glycoprotein 130；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian rapamycin target protein；TYK-2：酪氨酸激酶-2 tyrosine kinase-2；Th17：輔助性T細胞17 helper T cells 17。

3.1 IL-6-Janus激酶(JAK)-STAT3信號通路

IL-6是一種分子質量為21～28 ku的糖基化蛋白，包含184個氨基酸，細胞對IL-6的反應是通過由白細胞介素-6受體α(IL-6Rα)和糖蛋白130(gp130)組成的受體復合物介導的[39]。IL-6的信號傳導有3種模式：1)經典信號傳導。IL-6與同一細胞的膜結合受體白細胞介素-6受體(IL-6R)結合[40]。2)反式信號傳導。IL-6與可溶性白細胞介素-6受體(sIL-6R)結合[41]。3)反式表達。IL-6R與相鄰細胞的gp130結合[42-43]。JAK是一類重要的蛋白酪氨酸激酶，激活JAK-STAT信號通路需要2個JAK亞型作為自身磷酸化的同二聚體或異二聚體，從而允許募集和磷酸化各種信號分子，包括DNA結合蛋白的STAT家族的成員[44]。JAK家族包含4個細胞內蛋白，均為酪氨酸蛋白質激酶：JAK1[45]、JAK2、JAK3[46]和酪氨酸激酶2(TYK2)[47]，它們可以激活常見或不同類型的STAT成員(STAT1～4，STAT5a和5b，STAT6)[39]并由此啟動不同的下游細胞反應[48]。STAT可以被許多肽類蛋白如生長因子和細胞因子激活，是后生細胞磷酸酪氨酸調節(jié)信號傳導的重要介體之一[49]，既具有信號傳導作用又具有轉錄作用[50]。STAT在JAK的下游傳遞Ⅰ/Ⅱ型細胞因子信號：Ⅰ型細胞因子受體在其細胞外氨基酸結構域中具有某些保守的基序，包括常見的γ鏈(γc，也稱為IL-2受體γ亞基)細胞因子[如IL-2、白細胞介素-4(IL-4)和IL-21等]、gp130家族(如IL-6)、p40亞基[如白細胞介素-12(IL-12)和白細胞介素-23(IL-23)]和常見的β鏈細胞因子受體[如白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-5(IL-5)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等)[51]；Ⅱ型細胞因子受體是IL-10和干擾素(IFN)家族的成員[52]。IL-6-JAK-STAT3信號通路即IL-6與糖蛋白130受體(gp130R)的連接導致酪氨酸磷酸化，以及gp130R相關的JAK和胞質STAT3轉錄因子的活化[53]，然后磷酸化的STAT3二聚體轉運到細胞核，進而調節(jié)基因轉錄，最終參與炎癥反應的過程[54]。STAT3被IL-6R/gp130激活時發(fā)揮促炎作用，被白細胞介素-10受體(IL-10R)激活時發(fā)揮抗炎作用[55]。

3.2 Toll樣受體(TLR)4-髓樣分化因子88(MyD88)-核因子-κB(NF-κB)信號通路

TLR是一個Ⅰ型跨膜受體超家族[56]，在針對病原微生物或組織損傷的先天免疫應答中起重要作用。目前，在人體中發(fā)現(xiàn)約有10個功能性TLR(TLR1～10)，在小鼠中約有12個(TLR1～9，TLR11～13)[57]。除炎性細胞因子[如TNF-α和白細胞介素-1(IL-1)]之外，革蘭氏陰性細菌的外膜中的脂多糖(LPS)，革蘭氏陽性細菌細胞壁中的脂蛋白酸和肽聚糖，細菌鞭毛蛋白以及病毒等的單鏈或雙鏈RNA均可激活TLR[57]。TLR被刺激后，激活細胞內級聯(lián)反應，然后將刺激信號傳遞到與MyD88偶聯(lián)的下級信號蛋白NF-κB[58]。NF-κB是一種可誘導的轉錄因子，在免疫反應、炎癥反應、細胞分化以及正常和惡性細胞的存活中起著核心作用[59]。被激活的NF-κB可參與多種靶基因的轉錄調控，導致各種炎性因子及抗菌肽的釋放[60]，如使效應細胞分泌TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-1β、IL-6等促炎因子[61]，造成腸道組織損傷和IBD[56，62]。此外，Th17、Treg的分化也受NF-κB的調控。NF-κB包含Rel轉錄因子家族的5種蛋白質的二聚體：p105/p50、p100/p52、RelA(p65)、RelB和與v-Rel癌基因共享N端同源性的c-Rel[63]。在沒有刺激的情況下，這些亞基的異二聚體被核因子-κB抑制蛋白(IκB)保留在細胞質中[64]。受到細胞外刺激時，p65/c-Rel與p50組成的異二聚體或者RelB與p52組成的異二聚體的激活可以激活NF-κB信號通路[65]，p50和p52的二聚體為轉錄抑制劑[66]。c-Rel缺陷型CD4+T內iTreg生成受到嚴重阻礙，并且與體內Foxp3+T細胞數(shù)量減少相關[67]。c-Rel在高表達CC類趨化因子受體7(CCR7)的胸腺調節(jié)性T前體細胞(pre-tTreg)中高度激活，啟動Treg相關編碼基因的轉錄，促進pre-tTreg分化為胸腺調節(jié)性T細胞(tTreg)[68]。NF-κB c-Rel的消融能夠特異性地損害活化的調節(jié)性T細胞(aTreg)的生成和維持[69]。此外，c-Rel和p65可以通過促進Foxp3特異性增強體的形成來驅動Treg的發(fā)育[70]。由于Rorg/Rorc是Th17細胞中轉錄因子p65的直接靶標，因此當c-Rel或p65缺乏時，RORγtmRNA表達量降低，CD4+T向Th17分化減弱，且Th17的IL-17A/IL-17F表達量降低[29]。

3.3 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路

跨膜的受體酪氨酸激酶在幾種生長因子或細胞因子的刺激下被激活，而后與磷酸肌醇3激酶(PI3K)結合，激活PI3K-蛋白激酶B(AKT)-mTOR信號通路。PI3K是一種脂質激酶，可將磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)，抑癌基因PTEN為其抑制基因[71]。產生的PIP3通過PIP3和普列克同源(PH)結構域之間的特異性相互作用，將包含PH結構域的信號蛋白(如AKT)募集到質膜上[72]，活化的AKT通過直接磷酸化mTOR或磷酸化mTOR的負調控因子來刺激mTOR復合物，進而控制蛋白質翻譯和細胞生長[73]。mTOR的哺乳動物靶標是絲氨酸-蘇氨酸激酶，其活性受各種細胞外和細胞內因素(例如氨基酸、能量和激素)的調節(jié)，可以改變翻譯、轉錄、蛋白質合成和降解[74]，細胞信號傳導，新陳代謝[75]以及細胞骨架動力學的速度[76]。PI3K-AKT-mTOR信號通路可以調控細胞的新陳代謝、增殖、分化和生存等生命過程[77]。越來越多證據(jù)表明，PI3K-AKT-mTOR信號通路在炎癥反應發(fā)生的發(fā)展過程中起重要作用，是促炎關鍵因素，且對TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)、IL-1β、IL-6以及IL-12p40等細胞因子的釋放具有調節(jié)和保持其穩(wěn)定性的作用[78]，既可修復腸黏膜損傷，還可以維持腸上皮細胞正常代謝。此通路在腫瘤[71]、白血病[79]、血管及皮膚過度生長綜合征[77]等多種情況下都存在異常表達，與IBD在機體中的長期存在導致的胃腸道惡性腫瘤密切相關。

在效應CD4+T中，mTOR促進Th1、Th2和Th17分化，尤其對于Th17的體外和體內分化至關重要，缺乏mTOR的T細胞無法分化為Th17[80]。在細胞培養(yǎng)試驗中，微小核糖核酸(miRNA)可調節(jié)mTOR信號傳導，通過分別釋放抗炎或促炎因子以誘導或抑制腸道細胞自噬[81]。雷帕霉素(RAPA)可能通過限制必需氨基酸(EAA)抑制mTOR誘導Foxp3表達并促進從幼稚CD4+T生成Treg[82]。由此可見，PI3K-AKT-mTOR與Th17/Treg平衡密切相關，并且該信號通路可以經由Th17/Treg平衡調控IBD。

4 基于Th17/Treg平衡開發(fā)飼料添加劑或藥物調控IBD

尋找綠色環(huán)保型飼料添加劑替代抗生素一直是動物營養(yǎng)領域的研究熱點和畜牧行業(yè)的迫切需求。尤其是2020年全面“禁抗”政策出臺以來，這種需求變得尤為關切。研究表明，幽門螺桿菌定植可通過調節(jié)Th17/Treg平衡來預防慢性試驗性結腸炎[83]；蘆薈多糖按體重15 mg/kg結腸灌注可以顯著抑制大鼠結腸中RORγt的表達及STAT3的磷酸化，從而抑制Th17生成，促進Treg分化[84]；IL-33治療既可以增加葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發(fā)的慢性結腸炎小鼠中的Treg的反應，又可以降低Th17的反應[85]，緩解腸道損傷。大豆衍生的二肽和三肽可以抑制DSS誘導的豬結腸IL-1β、TNF、RORc和IL-17A以及Foxp3+T調節(jié)轉錄因子表達的上調，提示大豆衍生肽可以通過Th17/Treg平衡在體內發(fā)揮抗炎活性[86]。由此可見，Th17/Treg平衡的失衡可以加重或緩解動物IBD的癥狀。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg平衡對IBD的這種調控作用與許多信號通路密切相關。研究表明，姜黃素可以通過IL-6-STAT3信號通路調控Th17/Treg平衡治療小鼠的UC[87]。飼糧添加0.2%和0.4%的色氨酸可以抑制乙酸誘導的斷奶仔豬結腸組織STAT3的磷酸化、p65蛋白表達的上調和白細胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β、TNF-α、IL-6、TLR4 mRNA表達的上調[88]，降低仔豬結腸IFN-γ、IL-12 p40、IL-17A的mRNA表達[89]，提示色氨酸可能通過IL-6-JAK-STAT3和TLR4-NF-κB 2種信號通路的聯(lián)合作用參與Th17/Treg平衡對IBD的調控。腹腔注射抗菌肽CWA可以降低斷奶仔豬空腸組織TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB的mRNA表達和NF-κB、IκB-α的磷酸化水平，并促進IL-10的mRNA表達，提示抗菌肽CWA可能通過下調TLR4-MyD88-NF-κB信號通路緩解仔豬IBD[90]。鞏棟梁[91]通過建立熱應激豬的IBD模型證明，熱應激通過激活腸道組織中TLR4-NF-κB信號通路，上調炎性因子IL-6、IL-8和IL-17的表達，證明TLR4-NF-κB信號通路的激活可以促進Th17/Treg平衡向Th17一側偏移，添加TLR4特異性抑制劑可以緩解豬的IBD。雷公藤根提取物可以通過抑制IL-10缺乏小鼠結腸組織中的PI3K-AKT-mTOR信號通路來增強自噬，從而限制結腸炎癥[92]。孟憲邑[78]的研究表明，娃兒藤堿類化合物W-8對AKT/mTOR信號通路中AKT的磷酸化及其下游底物mTOR的活性有明顯的抑制作用，提示W-8可能通過對AKT/mTOR信號的阻斷間接上調了Foxp3基因表達的關鍵蛋白Smad3的磷酸化水平，并最終增強了Treg的分化。Xu等[93]的試驗證明，飼糧補充甘氨酸能夠降低LPS誘導的空腸TLR4、MyD88和NF-κBmRNA的表達和TNF-α、IL-1β和IL-6的過量產生，這說明甘氨酸可以通過抑制炎癥信號通路TLR4-NF-κB的活化來緩解IBD，并且可能通過抑制促炎因子的產生而抑制了Th17的分化和表達。Yi等[94]的試驗證明，飼糧補充N-乙酰半胱氨酸(NAC)能夠提高仔豬空腸mTORmRNA的表達，并減弱LPS誘導的PI3K和AKT磷酸化水平的相對降低，提示NAC可以通過PI3K-AKT-mTOR信號通路改善腸道細胞蛋白的合成[95]，改善腸道的完整性。綜上所述，目前已知大量的飼料添加劑或藥物可以有效緩解動物IBD，其作用機制可能是：Th17/Treg平衡相關的IL-6-JAK-STAT3、TLR4-MyD88-NF-κB、PI3K-AKT-mTOR等信號通路受外界刺激發(fā)生活化，進一步影響Th17或Treg的分化及其相關炎性細胞因子的表達，最終加重或緩解IBD。因此，我們可以開發(fā)各類綠色、無公害的飼料添加劑或藥物，借助這種免疫調節(jié)手段治療畜禽IBD，最終達到替代抗生素的效果。

5 小結與展望

IBD作為畜禽生產中最為常見的疾病之一，不僅危害動物健康、降低動物福利、損害養(yǎng)殖業(yè)者的經濟利益，還對環(huán)境保護工作造成巨大的壓力。Th17/Treg平衡作為重要的免疫調控途徑，受IL-6-JAK-STAT3、TLR4-MyD88-NF-κB、PI3K-AKT-mTOR等信號通路影響和調節(jié)，與眾多免疫細胞因子相關聯(lián)，可以對動物IBD產生二重性的調控作用。2020年7月起，我國飼料全面“禁抗”令開始正式實施，尋找和開發(fā)有效的“替抗”飼料添加劑和藥物已成迫在眉睫。因此，基于Th17/Treg平衡及其相關信號通路開發(fā)飼料添加劑或藥物對于治療IBD在抗生素替代方面具有重要意義。然而，目前用Th17/Treg平衡調控反芻動物、水產動物、禽類及除豬以外其他單胃動物IBD的研究仍然較為少見，并且已知可以產生調控作用的添加劑和藥品在其具體作用機制、動物應用安全性等方面仍有待進一步研究。因此，從這些方面出發(fā)而展開的研究將為今后Th17/Treg平衡更好地應用于動物生產提供科學依據(jù)。