邱豐俊，李杜，朱一唯，閆曉風(fēng)，葉?杰，王曉玲，胡旭東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

酒精性脂肪性肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）是長期過量飲酒而導(dǎo)致肝臟的早期病變，主要以肝臟中脂質(zhì)沉積為特征[1]。酒精已成為慢性肝病的主要因素之一[2]。Ohashi等[3]發(fā)現(xiàn)，約90%酗酒者會發(fā)展為AFLD，并進一步發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化，甚至肝硬化等。因此，防治AFLD對遏制肝臟不可逆損傷從而截斷酒精性肝病進程有重要意義。一貫煎是養(yǎng)肝陰、疏肝氣中醫(yī)經(jīng)典方劑，對酒精性肝病患者有良好的降脂和保肝作用[4]，但一貫煎治療AFLD的具體分子機制尚未闡明。因此，本研究通過AFLD小鼠模型和細胞模型，探討一貫煎防治AFLD的潛在信號通路。

1 實驗材料

1.1 動物和飼料

C57BL/6雌性小鼠24只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0006，動物使用許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室，動物倫理審查編號PZSHUTCM190712014。Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030C、TP4030D），購于江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 細胞和藥物

AML12小鼠肝細胞株（ATCC編號CRL-2254），購于中國科學(xué)院細胞庫。一貫煎（生地黃18 g，北沙參10 g，麥冬10 g，當(dāng)歸10 g，枸杞子12 g，川楝子4.5 g），飲片購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆丛奖壤椭品ㄓ缮虾Ｖ嗅t(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心制成流浸膏，再由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成干粉（批號20180515），冷藏保存，每克干粉含原藥材2.196 g。

1.3 主要試劑與儀器

無水乙醇（滬式10009218AR）、二甲基亞砜（滬式30072418AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰酶（貨號25200-072）、DMEM/F12培養(yǎng)基（貨號12400-024）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（貨號41400-045），Thermo Fisher Scientific公司；地塞米松（貨號D1756），Sigma公司；青-鏈霉素溶液（貨號GNM15140），吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Nile Red熒光染料（貨號HY-D0718）、DAPI熒光染料（貨號HY-D0814），MCE公司；總RNA提取試劑盒（貨號15596026），Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號K1622），Thermo Fisher Scientific公司；擴增試劑盒（貨號M3003L），Luna公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（貨號C009-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（貨號C010-1）、三酰甘油（TG）測試盒（貨號A110-1），南京建成生物工程研究所；TGFBR2抗體（貨號abs101230）、SLC2A4抗體（貨號abs131486），愛必信（上海）生物科技有限公司。Forma371細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司），BSC-1600IIB2生物安全柜（上海上凈凈化設(shè)備有限公司），5418R低溫離心機（Eppendorf公司），Axiovert40 CFT熒光倒置生物顯微鏡（徳國Zeiss公司），Synergy 2酶標(biāo)儀（BioTek公司），LightCycler96實時熒光定量PCR儀（Roche公司）。

2 實驗方法

2.1 造模及給藥

將小鼠隨機分為對照組、模型組和一貫煎組，每組8只。按照文獻[5]方法制備AFLD小鼠模型。對照組給予Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030C）喂養(yǎng)15 d；模型組和一貫煎組先予Lieber-DeCarl液體飼料（TP4030C）適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，再連續(xù)喂食含5.0%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030D）10 d。同時一貫煎組每日給予一貫煎溶液灌胃，對照組和模型組按體質(zhì)量給予等體積生理鹽水灌胃。第16日上午，對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，一貫煎組予一貫煎溶液灌胃；1 h后模型組和一貫煎組按20 μL/g小鼠體質(zhì)量給予31.5%乙醇（V/V）灌胃，對照組按相同劑量予45.0%糊精（W/V）灌胃；9 h后（期間禁食不禁水）處死所有小鼠，取肝組織備用，血液標(biāo)本以3000 r/min離心15 min，取上層血清分裝備用。

一貫煎溶液配制：每次稱取一定量一貫煎干粉，生理鹽水溶解，配制成濃度為含原藥材0.793 8 g /mL一貫煎溶液，預(yù)熱后每日給予7.938 g/kg（按65 kg成人體質(zhì)量臨床用量8倍）劑量進行小鼠灌胃[6]。

2.2 HE染色

石蠟切片，脫蠟至水（將切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min，自來水洗）；蘇木素染色（將切片放入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水再洗，返藍液返藍，流水沖洗）；伊紅染色（將切片依次放入85%、95%酒精分別脫水5 min，然后放入伊紅染液中染色5 min）；脫水封片（將切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性樹膠封片）；顯微鏡觀察，圖像采集分析。

2.3 油紅O染色

油紅O染色法常用于組織內(nèi)TG等中性脂肪的特異性染色。按貯備液∶稀釋液＝5∶2配制油紅O應(yīng)用液，配好后濾紙過濾2遍，去除殘渣。將肝組織冰凍切片放置在切片架上，室溫回溫10 min，然后將切片放入裝有油紅O應(yīng)用液的染缸中染色13 min，37 ℃蒸餾水洗20 s，復(fù)染液中染色5 min，自來水洗60 s，表面水分干透前滴加水性封固劑加蓋玻片封片，鏡下觀察肝組織內(nèi)脂肪生成情況。

2.4 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和三酰甘油含量測定

將5 μL血清樣本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板，各孔分別加入20 μL基質(zhì)液，37 ℃水浴孵育30 min；各孔分別加入20 μL 2,4-二硝基苯肼液，37 ℃水浴孵育20 min；各孔分別加200 μL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫放置15 min，于酶標(biāo)儀波長510 nm處測定各孔OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算血清ALT、AST含量。將2.5 μL血清樣本加入96孔板，同時設(shè)校準(zhǔn)孔和空白孔；加入200 μL工作液，37 ℃水浴孵育10 min，于酶標(biāo)儀波長510 nm處測定各孔OD值，計算TG含量。TG（mmol/L）＝（樣本OD值－ 空白OD值）÷（校準(zhǔn)OD值－空白OD值）×校準(zhǔn)品濃度（2.26 mmol/L）。

2.5 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.5.1 測序

根據(jù)試劑盒（RNAiso Plus試劑盒和RNeasy Mini試劑盒）的標(biāo)準(zhǔn)操作流程分別抽取各組小鼠肝組織樣本總RNA，所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后，使用RNAClean XP Kit和RNase-Free DNase Set對總RNA進行純化。將純化后的總RNA進行mRNA的分離、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、末端修復(fù)、3’末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建。所建文庫分別采用Qubit?2.0 Fluorometer檢測其濃度，Agilent2100檢測文庫大小。依據(jù)cBot操作指南中的相應(yīng)流程，采用Illumina測序儀配套的cBot完成cluster的生成和第一向測序引物的雜交。依據(jù)Illumina User Guide提供的測序試劑，將帶有cluster的流動池上機，用paired-end程序進行雙端測序。并采用Illumina提供的數(shù)據(jù)收集軟件對測序進行控制，同時進行實時數(shù)據(jù)分析。

2.5.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過Seqtk（https∶//github.com/lh3/seqtk）對測序所得讀長進行篩選，主要過程：去除讀長中的接頭序列；去除3’端質(zhì)量Q＜20的堿基（堿基錯誤率＜0.01）；去除長度＜25的讀長；去除所屬物種的核糖體RNA數(shù)據(jù)。用篩選后的測序讀長進行下一步分析。

2.5.3 基因表達差異性分析和KEGG富集

為獲得樣品的可比較差異基因數(shù)據(jù)，通過StringTie軟件計數(shù)、TMM（M值的修剪平均值）標(biāo)準(zhǔn)化和perl腳本計算3個步驟將測序讀長轉(zhuǎn)換為FPKM（每百萬映射讀長外顯子模型的每千個堿基片段），從而將基因表達標(biāo)準(zhǔn)化。采用edgeR[7]進行樣本間差異基因分析，得出P值后進行多重假設(shè)檢驗校正，通過控制FDR（false discovery rate）決定P的閾值，校正后的P值即q值。同時，根據(jù)FPKM值計算差異表達倍數(shù)。差異基因篩選條件如下：q≤0.05，差異表達倍數(shù)≥2。以上實驗委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

篩選出模型組和正常組的差異表達基因及一貫煎組和模型組的差異表達基因后，將篩選出的差異基因作進一步交集分析，并將交集中的差異表達基因?qū)隓AVID Bioinformatics Resources 6.8（https∶//david. ncifcrf.gov/summary.jsp）完成KEGG通路富集分析。

2.6 RT-qPCR檢測

將RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序后返回的肝組織樣本總RNA進行部分基因的RT-qPCR實驗，檢驗RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。首先將樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進一步擴增，用2-ΔΔCt法定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，檢測各組樣本中FOXO信號通路（KEGG富集所得分析差異最顯著的信號通路）相關(guān)基因表達變化。所有引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 細胞培養(yǎng)及給藥

稱取0.301 g一貫煎干粉（每克干粉含原藥材2.196 g），溶于3 mL完全培養(yǎng)液，制成原藥材濃度為220 mg /mL的一貫煎母液，0.22 μm濾膜過濾，每管50 μL分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將AML12細胞按104cells/孔接種于96孔板，使用含10%FBS、1%ITS、40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計對照組、模型組（50 mmol/L酒精）、一貫煎組（50 mmol/L酒精＋一貫煎900、300、100、33 μg/mL）、TGFBR2抗體組（50 mmol/L酒精＋TGFBR2抗體500、50、5 ng/mL）、SLC2A4抗體組（50 mmol/L酒精＋SLC2A4抗體500、50、5 ng/mL），加入相應(yīng)試劑后分別孵育24 h，待測。

2.8 Nile Red染色

Nile Red是一種廣泛使用的親脂性熒光染料，可用于評價細胞中TG等中性脂肪的含量[8]。將孵育24 h的96孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸去細胞上清液，PBS洗3次；10%中性福爾馬林常溫固定細胞20 min，PBS洗3次；用1 μg/mL Nile Red染液37 ℃染色10 min，PBS洗3次；37 ℃、1 μg/mL DAPI染細胞核10 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡下拍照，用Image J軟件進行數(shù)據(jù)處理。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad8.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，不同樣本之間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HE染色結(jié)果

模型組酒精液體飼料喂養(yǎng)后，小鼠肝細胞呈脂肪樣空泡，氣球樣變明顯，肝索結(jié)構(gòu)紊亂；一貫煎組小鼠肝細胞內(nèi)空泡狀物質(zhì)減少，氣球樣變減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.2 油紅O染色結(jié)果

模型組小鼠肝組織中紅色脂滴含量增加，且脂滴明顯變大；一貫煎組脂滴變小，含量降低。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織TG含量比較（油紅O染色，×200，±s，n＝3）

4.3 一貫煎對模型小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和三酰甘油含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、TG含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；與模型組比較，一貫煎組小鼠血清ALT、TG含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；模型組、一貫煎組血清AST含量較對照組均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠血清ALT、AST、TG含量比較（±s，n＝3）

4.4 靶點基因及主要靶點通路篩選結(jié)果

與對照組比較，模型組817個基因顯著上調(diào)，358個基因顯著下調(diào)；與模型組比較，一貫煎組197個基因顯著上調(diào)，347個基因顯著下調(diào)。為明確一貫煎防治AFLD小鼠主要靶點基因，對模型組與對照組及一貫煎組與模型組的差異表達基因進行交集分析。共得到133個靶點基因，其中模型組表達降低、一貫煎干預(yù)后表達升高的靶點基因33個；模型組表達升高、一貫煎干預(yù)后表達降低的靶點基因100個。將交集分析所得的133個靶點基因進一步通過KEEG數(shù)據(jù)庫進行信號通路富集。結(jié)果顯示，靶點基因在FOXO通路上富集最為顯著（P＝8.8E-3），共有5個靶點基因分布在該通路，分別是TGFBR2、SLC2A4、KLF2、SGK2、TNFSF10（見表2、圖4），其中TGFBR2和SLC2A4是細胞膜受體蛋白。該結(jié)果提示，一貫煎可能通過TGFBR2和SLC2A4介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮防治小鼠AFLD的作用。

4.5 RT-qPCR驗證結(jié)果

差異基因RT-qPCR檢測結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果一致，見圖5、表3。

表2 一貫煎防治小鼠AFLD靶點基因KEGG通路富集結(jié)果

圖4 一貫煎治療AFLD關(guān)鍵靶點及其相關(guān)信號通路示意圖

圖5 各組小鼠肝組織TGFBR2、SLC2A4、KLF2、SGK2、TNFSF10基因表達比較（±s，n＝3）

表3 FOXO通路差異基因表達變化倍數(shù)

4.6 TGFBR2和SLC2A4抗體對AML12細胞脂肪變性的影響

小鼠肝組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，細胞膜受體蛋白TGFBR2和SLC2A4可能在小鼠肝細胞脂肪變性過程中發(fā)揮重要作用，因此后續(xù)通過酒精體外誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性進行進一步驗證。分別使用濃度為500、50、5 ng/mL的TGFBR2和SLC2A4抗體與50 mmol/L酒精同時孵育AML12細胞。結(jié)果顯示，各濃度SLC2A4抗體對酒精誘導(dǎo)的AML12細胞內(nèi)脂質(zhì)生成作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TGFBR2抗體50、5 ng/mL能顯著抑制酒精誘導(dǎo)的AML12細胞內(nèi)脂質(zhì)生成（P＜0.05），且50 ng/mL TGFBR2抗體降脂效果更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖6。提示TGFBR2與肝細胞酒精性脂肪變性密切相關(guān)，后續(xù)研究選用50 ng/mL的TGFBR2抗體進行實驗。

圖6 不同濃度TGFBR2和SLC2A4抗體對AML12細胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

4.7 一貫煎對酒精誘導(dǎo)的AML12細胞脂肪變性的影響

為驗證一貫煎對酒精誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性的影響，將原藥材濃度分別為900、300、100、33 μg/mL一貫煎溶液與50 mmol/L酒精同時孵育AML12細胞24 h，結(jié)果300 μg/mL一貫煎溶液抑制脂質(zhì)生成效果最明顯（P＜0.001），見圖7。因此，后續(xù)研究選用濃度為300 μg/mL一貫煎溶液進行實驗。

4.8 一貫煎和TGFBR2抗體對AML12細胞脂肪變性的影響

將300 μg/mL一貫煎溶液和50 ng/mL TGFBR2抗體單獨或聯(lián)合與50 mmol/L酒精共同孵育AML12細胞。結(jié)果300 μg/mL一貫煎、50 ng/mL TGFBR2抗體、300 μg/mL一貫煎＋50 ng/mL TGFBR2抗體均能顯著減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細胞內(nèi)脂質(zhì)生成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），見圖8。提示一貫煎可能通過TGFBR2通路減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細胞脂肪變性。

圖7 不同濃度一貫煎對酒精誘導(dǎo)的AML12細胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

圖8 一貫煎和TGFBR2抗體對AML12細胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

5 討論

一貫煎出自《續(xù)名醫(yī)類案》，由北沙參、麥冬、當(dāng)歸、生地黃、枸杞子、川楝子6味中藥組成[9]，主治肝腎陰虛證，可統(tǒng)治脅痛、吞酸、吐酸、疝瘕一切肝病[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，其對酒精性肝病具有一定作用[4]。研究表明，一貫煎可降低酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、堿性磷酸酶和總膽紅素等水平，對酒精灌胃所致大鼠肝細胞損傷有一定防治作用[11]。此外，一貫煎具有抗脂肪肝功能[12]，但防治AFLD的分子機制尚無報道。本研究通過一貫煎灌胃給藥作用于AFLD模型小鼠，結(jié)果顯示其可顯著降低小鼠血清ALT、TG含量，減輕小鼠肝損傷及肝臟脂肪變性。體外細胞實驗也表明，一貫煎可顯著減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細胞脂肪變性。

RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)又稱全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序，主要以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，將mRNA、small RNA和non-coding RNA等通過高通量測序技術(shù)檢測其堿基序列[13]。針對中藥具有多組分、多靶點的特點，為進一步明確一貫煎改善小鼠AFLD的分子機制，本實驗采用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測小鼠肝組織基因表達，共發(fā)現(xiàn)了133個差異表達基因。通過差異表達基因的KEEG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO信號通路基因關(guān)聯(lián)度最高（P＝8.8E-3），TGFBR2、SLC2A4、TNFSF10、KLF2、SGK2這5個基因富集于FOXO信號通路，其中TGFBR2和SLC2A4是膜受體蛋白。進一步的體外細胞實驗顯示，拮抗TGFBR2受體蛋白可顯著減輕酒精誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性，但拮抗SLC2A4受體蛋白并不能減輕酒精誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性，表明TGFBR2介導(dǎo)的信號通路在小鼠AFLD進程中起到更重要的作用。細胞實驗結(jié)果還顯示，一貫煎、TGFBR2抗體單用或聯(lián)用均能顯著減輕酒精誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)生成，但三者作用相互間無明顯差異，提示一貫煎可能通過TGFBR2通路減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細胞脂肪變性。

金云云[14]發(fā)現(xiàn)，TGFBR2與成脂細胞分化和凋亡相關(guān)；Yang等[15]使用肝細胞特異性TGFBR2基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR2缺失后可通過增加與β氧化相關(guān)基因的表達減輕膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性和炎癥?？梢奣GFBR2與調(diào)控細胞脂質(zhì)代謝有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR2通路與AFLD聯(lián)系密切，但具體分子機制尚需進一步探索和闡明。

綜上所述，一貫煎可能通過影響小鼠肝細胞膜受體蛋白TGFBR2介導(dǎo)的信號通路，減少細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，從而減輕酒精誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性，起到防治AFLD的藥理效應(yīng)。