張 紅， 黃志銀， 李 梅， 范偉強， 華德平， 王超楠

(1.天津科潤蔬菜研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室， 天津 300381；2.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300354)

青麻葉大白菜(BrassicacampestrisL. ssp. pekinensis)是天津地區(qū)的特色種質(zhì)資源，它對不良的氣候和土壤條件具有較強的適應(yīng)能力，耐冬季儲運，加之外形直順，口感佳，一直是京津地區(qū)人民餐桌上不可缺少的蔬菜之一。近年來，由于青麻葉等大白菜栽培效益好，復(fù)種指數(shù)高，市場范圍逐漸擴大，但一種世界性土傳病害根腫病的發(fā)生嚴重限制了青麻葉大白菜的安全生產(chǎn)。根腫病由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害大白菜等十字花科蔬菜，據(jù)統(tǒng)計，我國有20多個省、市、自治區(qū)都存在十字花科作物根腫病發(fā)病的情況，且發(fā)病面積不斷增加，有1/3以上的十字花科作物種植區(qū)受到根腫病的侵染，其中西南地區(qū)和中部地區(qū)最為嚴重[1-3]。但試驗證明，青麻葉大白菜中缺乏對根腫病的抗性[4]，在云南、湖北等病害高發(fā)地區(qū)青麻葉的栽培極易受到損害[5-7]。因此，隨著我國根腫病發(fā)病區(qū)域越來越廣、病情越來越嚴重，亟需選育出抗根腫病的青麻葉大白菜。

傳統(tǒng)的抗病育種手段僅依靠田間表型和育種經(jīng)驗，不但會受到主觀意識的影響，而且由于存在連鎖累贅，當與目標性狀緊密連鎖的遺傳物質(zhì)通過表型無法表現(xiàn)出來時，將降低篩選的效率，此外，傳統(tǒng)田間育種周期長，工作量大，費時費力費地，弊端明顯。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標記輔助育種技術(shù)(Marker Assisted Selection，MAS)相較于傳統(tǒng)的經(jīng)驗育種，大大縮短了新品種的選育周期，既降低了選育過程中的工作量，也能從基因水平上確保篩選的準確性。分子標記輔助育種技術(shù)也逐漸被國內(nèi)外育種家廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、白菜等作物中[8-12]，但針對天津特色種質(zhì)資源青麻葉大白菜的抗根腫病育種研究尚存在空白，加之國內(nèi)外學(xué)者對分子標記輔助育種的研究多專注于標記的挖掘及開發(fā)，針對篩選效率的研究相對缺乏。本研究旨在通過探究影響篩選效率的幾個重要因素，提高選育效率，以期構(gòu)建一套快速高效的抗根腫病青麻葉近等基因系體系，不僅有助于快速選育出性狀優(yōu)良、抗性佳的種質(zhì)資源，同時對提升天津市大白菜分子育種水平具有重要研究意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試材來源：G 57含有根腫病抗性基因CRb，被作為供體親本材料；H 227是具有優(yōu)良性狀的青麻葉大白菜，但缺乏根腫病抗性基因，被作為輪回親本。兩試驗材料均由天津科潤蔬菜研究所大白菜課題組提供。

菌株來源：供試菌株采集自湖北長陽賀家坪的大白菜發(fā)病腫根中，該菌經(jīng)Williams方法鑒定為致病性強的4號生理小種[13-15]，菌株取回后洗凈干燥處理，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1分子標記的前景選擇及背景選擇

前景選擇：首先將G 57中開發(fā)的分子標記Bra 0235-2和Bra 19317在抗感雙親G 57和H 227中進行多態(tài)性驗證，具有穩(wěn)定多態(tài)性則作為前景選擇，用于各回交世代篩選兼具抗病帶型的單株進行回交轉(zhuǎn)育。

背景選擇：首先選擇覆蓋大白菜全基因組的分子標記[16-17]在親本間進行多態(tài)性分析。然后從多態(tài)性標記中篩選出均勻分布于大白菜基因組的分子標記，應(yīng)用于BC1F1群體及其以后世代的基因組背景分析。根據(jù)基因組背景分析，在每個世代選擇輪回親本基因組含量高的單株用于回交或自交，最后獲得兼具抗根腫病和輪回親本優(yōu)良性狀的近等基因系。

1.2.2供試群體數(shù)對標記篩選效率的影響

2018年秋季，在武清基地育苗棚將試材播種于72孔穴盤培養(yǎng)，從BC1F1代的一個群體中隨機選擇5,9,18,27,36株進行分子標記的篩選，每個樣本量重復(fù)3次，出苗后采集葉片，確定用于各回交世代的最佳供試群體數(shù)。

1.2.3分子標記背景選擇的最初世代對篩選效率的影響

試材同樣播種于武清基地育苗棚，在其他條件相同的情況下，分別對BC1F1、BC2F1、BC3F1群體的入選單株進行分子標記背景選擇，每個處理重復(fù)3次，對背景回復(fù)率進行分析，確定開展分子標記背景選擇的最佳世代。

2019年3月，將種子播種到育苗盤中，正常管理，育苗培養(yǎng)30 d后，待幼苗長到5～6片真葉時取樣，采集葉片2～3片保存于-40 ℃，用于DNA提取。分子試驗在天津科潤蔬菜研究所分子實驗室開展。

1.2.4大白菜基因組DNA提取及SSR分析

DNA提取：采用改良后的堿裂法提取葉片DNA[18-20]，技術(shù)具體過程如下：

1) 取葉片放入2 mL離心管中，然后加入150 μL 0.4 mol·L-1的NaOH溶液，加入磁珠放于高速研磨機內(nèi)，65 Hz，研磨75 s。

2) 取出離心管，以4 000 r·min-1，離心5 min。吸取40 μL上清液放入新的離心管。

3) 最后加入200 μL Tris-HCl，混勻備用。

采用10 μL的PCR反應(yīng)體系，各成分具體含量如表1。

表2 前景選擇分子標記引物序列

注：C 1、C 2、C 3是樣本量為18時的3次重復(fù)試驗

表1 大白菜PCR標準反應(yīng)體系

PCR擴增：94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃(根據(jù)引物合成溫度調(diào)節(jié))退火30 s；72 ℃延伸30 s，一般30～35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。最后將擴增產(chǎn)物4 ℃保存。

以8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，然后使用快速銀染法檢測電泳條帶多態(tài)性。膠片取出后置于燈箱上觀察、照相，對條帶進行統(tǒng)計并記錄。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)篩選出的具有多態(tài)性SSR引物擴增結(jié)果，在相同遷移位置上，帶型與輪回親本帶型相同者賦值為“0”，與供體親本帶型相同者賦值為“2”，為雙親共同的雜合帶型賦值為“1”，缺失標記賦值為“—”。最后利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

實際輪回親本基因組含量(%)=(SSR標記位點純合數(shù)/SSR標記總數(shù))×100%；

輪回親本基因組含量期望值=(1-1/2r+1)×100%，式中：r為回交次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前景標記的篩選

課題組前期開發(fā)設(shè)計的抗源材料G 57中抗根腫病基因CRb連鎖的分子標記Bra 0235-2和Bra 19317，經(jīng)驗證在抗感雙親12 G 57和H 227間多態(tài)性表現(xiàn)好，可用于各世代的前景選擇。

圖1 兩標記在雙親間的多態(tài)性驗證

2.2 背景標記的篩選

在分布于大白菜基因組的680個SSR標記中[21-22]，選擇均勻分布于10條染色體的140個分子標記，通過父母本間的篩選，獲得穩(wěn)定的多態(tài)性標記20個，可用于各世代的背景選擇，序列信息見表2，上述引物均由華大基因公司合成。

2.3 不同供試群體數(shù)量對標記Bra 019317篩選效率的影響

研究結(jié)果(圖2、表4)表明，在每一株系中標記篩選的樣本量至少達到5株才可能篩選出含目標性狀的抗病單株。但從背景回復(fù)率考慮，樣本量至少達到18株的回交群體中獲得輪回親本背景恢復(fù)率高的近等基因系的幾率更高。為在工作效率與中選率中尋找一個平衡點，建議后期篩選的株系樣本量設(shè)定為18株。

表3 背景選擇分子標記引物序列

表4 不同數(shù)量的BC1F1群體篩選抗病帶型的統(tǒng)計結(jié)果

2.4 分子標記背景選擇的最初世代對篩選效率的影響

試驗從BC1F1世代起在分子標記前景選擇的基礎(chǔ)上，利用20個背景選擇標記對3個回交世代群體的入選單株進行遺傳背景回復(fù)率統(tǒng)計(表5、表6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1代回交，54個樣本量的BC1F1群體的背景回復(fù)率范圍為16.7%～78.0%，RPG含量最高為78.0%，高于回交1代的期望值(75.0%)，但樣本間變異系數(shù)略大，變異系數(shù)為28.6%；回交2代后，BC2F1群體的背景回復(fù)率范圍為38.9%～94.4%，RPG含量最高為94.4%，高于回交2代的期望值(87.5%)，且變異系數(shù)為18.4%；回交3代后，BC3F1群體的背景回復(fù)率范圍為33.3%～85.2%，RPG含量最高為85.0%，低于回交3代的期望值(93.75%)，變異系數(shù)為16.5%。說明在各個回交世代中群體均存在極端個體，但在回交2代后群體間RPG差異相對更小，此時在背景選擇的分子標記已獲得的情況下，盡早利用背景選擇篩選目標單株，可以加快恢復(fù)輪回親本的基因組含量，節(jié)省人力、物力的投入，有效提高MAS的效率。

3 討 論

分子標記輔助育種技術(shù)(MAS)是目前提高傳統(tǒng)育種效率的常見手段，構(gòu)建高效準確的MAS體系必須對篩選環(huán)節(jié)的各影響因素進行系統(tǒng)研究，例如分子標記與基因間的連鎖程度，背景選擇的標記數(shù)量等因素決定著MAS選擇的準確性，群體的篩選數(shù)量，背景選擇開始的世代等因素影響著MAS選擇的效率。

分子標記輔助選擇的準確性主要在于前景標記與目標基因間的連鎖度，一般連鎖越緊密，選擇的準確率越高，需要篩選的樣本量數(shù)越少，此外目標基因的連鎖標記數(shù)量對篩選的準確率也產(chǎn)生影響。潘海軍等[23]發(fā)現(xiàn)，針對豐富23群體，分別利用單標記RpdH 5和RpdSll 84進行分子標記輔助選擇的準確率為91.0%和87.3%，但同時利用這2個標記，篩選準確率可提高到99%。此外，群體的篩選數(shù)量對MAS的選擇效率也起著重要作用。群體過大，篩選的工作量增加，往往造成人力物力的損耗。群體過小，目標性狀中選率則必然降低，尤其是在一些低世代群體或低遺傳率的性狀存在的情況下更為明顯。因此本試驗利用2個自主設(shè)計的連鎖標記作為前景選擇，在保證目標單株準確性的前提下，采用前景選擇和背景相結(jié)合的方法，對不同大小的群體進行目標單株的統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選群體數(shù)量達5株即可獲得目標單株，但群體數(shù)量至少為18株時，才能獲得兼具目標基因與高RPG的單株，這與張騰等[24]的研究結(jié)論基本一致。發(fā)現(xiàn)通過前景選擇隨機選擇7株即可獲得含目標基因的單株，通過背景選擇從20株回交群體中更易獲得RPG含量高的單株。分析2個試驗群體數(shù)量的細小差異可能是由于標記的連鎖程度造成。

表5 同樣本量下不同回交世代背景篩選的目標單株統(tǒng)計結(jié)果

表6 各回交群體背景回復(fù)率統(tǒng)計結(jié)果

針對背景選擇執(zhí)行世代的影響，Hospital等[25]認為，對單個或者連續(xù)多個回交世代進行目標單株篩選，背景選擇執(zhí)行的越晚，效率越高。但試驗中發(fā)現(xiàn)，從回交2代起開展背景選擇相對獲得高RPG的目標單株概率會更高，而且群體間RPG差異更小，可能是由于低世代群體內(nèi)重組個體多，變異方差大，所以目標單株中選率大，而隨著世代的增加，MAS效率會逐漸降低。