劉丹 吳曉彤

摘 要：食源性二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制活性肽成為近年來健康產(chǎn)品研究的方向之一。本研究以驢血紅蛋白為原料，采用計算機模擬蛋白水解方法篩選最佳蛋白酶，研究酶解時間、溫度和加酶量對蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）和酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率的影響，響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的工藝條件。結(jié)果表明，最佳蛋白酶為蛋白酶K，驢血紅蛋白源制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、溫度65 ℃、pH 8、加酶量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.44%。

關(guān)鍵詞：驢血紅蛋白;蛋白酶K;響應(yīng)面分析法;二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽

Optimization of Enzymatic Preparation of Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ Inhibitory Peptides from Donkey Hemoglobin

LIU Dan， WU Xiaotong*

（School of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010000， China）

Abstract： Food-derived dipeptidyl peptidase （DPP） Ⅳ inhibitory peptide has become an important direction of research on dietary supplements in recent years. In this study， donkey hemoglobin was hydrolyzed with proteases to produce DPP-Ⅳ inhibitory peptide. The best protease was selected by computer simulation of protein hydrolysis. The effects of hydrolysis time， temperature and enzyme dosage on the degree of hydrolysis and DPP-Ⅳ inhibitory activity were studied. The process conditions were optimized by response surface methodology. The results showed that protease K was the best enzyme for the production of DPP-Ⅳ inhibitory peptide. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows： substrate concentration 1%， hydrolysis time 3.15 h， temperature 65 ℃， pH 8.00， and enzyme dosage 400 U/g. The inhibition rate of DPP-Ⅳ by 2 mg/mL of the hydrolysate prepared using these conditions was 53.44%.

Keywords： donkey hemoglobin; protease K; response surface analysis; dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitory peptides

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296

中圖分類號：TS251.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）02-0019-06

引文格式：

劉丹， 吳曉彤. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備驢血紅蛋白源二肽基肽酶-Ⅳ抑制活性肽[J]. 肉類研究， 2021， 35（2）： 19-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Dan， WU Xiaotong. Optimization of enzymatic preparation of dipeptidyl peptidase-Ⅳ inhibitory peptides from donkey hemoglobin[J]. Meat Research， 2021， 35（2）： 19-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296.? ? http：//www.rlyj.net.cn

隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人們的生活方式特別是飲食習慣發(fā)生巨大變化，營養(yǎng)攝入的不均衡導致肥胖和糖尿病等慢性代謝疾病的發(fā)生率逐年上升。糖尿病已逐漸成為世界范圍內(nèi)日益嚴重的社會健康問題，預(yù)計到2040年，將會有6.42億成年人患糖尿病[1]。

二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制劑是新型糖尿病治療藥物[2]。然而，長期服用合成的DPP-Ⅳ抑制劑會產(chǎn)生耐藥性和肝腎損傷等副作用[3]。生物活性肽是對生物機體生命活動有益或是具有生理作用的肽類化合物，是一類分子質(zhì)量小于6 000 Da，具有多種生物學功能的多肽[4]，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一，介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，由2 個至數(shù)十個氨基酸通過肽鍵連接而成[5]。DPP-Ⅳ抑制活性肽主要來源于天然動植物，具有生物活性高、副作用低等優(yōu)點，在高效性和安全性等方面具有突出優(yōu)勢[6]，具有輔助控制血糖水平的潛力[7]。

近年來，已從豆類[7]、藜麥[8]、谷物[9]、油菜[10]、豬皮凝膠[11]、豬骨骼肌[12]、乳清蛋白[13]、酪蛋白[14]和駱駝乳[15]等中水解得到DPP-Ⅳ抑制肽。關(guān)于血液中DPP-Ⅳ抑制肽鮮有報道。血中富含血紅蛋白，血紅蛋白由2 個

α-亞基和2 個β-亞基組成，是一種非膜的復(fù)合變構(gòu)蛋白，能運輸氧并調(diào)節(jié)血液酸堿平衡[16]，血紅蛋白酶解肽段具有抗氧化[17-18]、降血壓[19-20]和抗菌[21-22]等多種活性，且分子質(zhì)量小，可被直接吸收[23]，是一種非常有前途的功能性食品原料。生物信息學是用于管理、規(guī)劃和解釋與生物系統(tǒng)相關(guān)信息的計算方法，它利用各種數(shù)據(jù)庫、在線工具和軟件等獲取目標功能。利用ExPASy Cutter[24]和BIOPEP[25]等在線平臺的肽剪切工具，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列及特異蛋白酶的剪切位點在理論上預(yù)測肽的組成，并將肽段與數(shù)據(jù)庫中的DPP-Ⅳ多肽進行比較[26]，從而選擇合適的底物及蛋白酶。

本研究以驢血紅蛋白為原料，通過借助ExPASy Cutter和BIOPEP在線平臺篩選合適的蛋白酶。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件制備驢血紅蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，為推動DPP-Ⅳ抑制活性肽產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)，以提高驢血的附加值，促進驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇檢疫合格的3 歲烏公驢，在宰殺過程中收集新鮮血液，通過20 目篩后濾入含有1%檸檬酸鈉抗凝劑容器中。上述過程于內(nèi)蒙古呼和浩特市蒙驢食品定點屠宰場完成。

蛋白酶K（40 U/mg） 德國Merck公司;DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒 美國Abnova公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索來寶科技有限公司;氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、檸檬酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;5804R高速冷凍離心機 艾本德（中國）有限公司;DK-8D水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-3C雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;MULTISKAN GO全光譜酶標儀 美國Thermo Fisher公司;凝膠成像儀、Mini protein II型垂直電泳系統(tǒng)? ?美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 驢血紅蛋白的提取及SDS-PAGE分析

采集新鮮驢血過20 目篩后，放入含有1%檸檬酸鈉抗凝劑容器中，5 000×g、4 ℃條件下離心5 min，去上層，按上述步驟重復(fù)3 次，收集紅細胞，置于4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩⒓t細胞中加入2 倍體積4 ℃預(yù)冷的去離子水，于4 ℃冰柜中靜置過夜后，12 000×g、4 ℃條件下離心20 min，去沉淀，收集上清液，即得驢血紅蛋白。采用SDS-PAGE檢測驢血紅蛋白純度，分離膠質(zhì)量分數(shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分數(shù)5%、電壓110 V、電泳時間90 min。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍染色，脫色后將膠片置于膠片觀察燈上觀察。

1.3.2 計算機模擬酶解驢血血紅蛋白

利用UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）獲得原料蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，由在線軟件PeptideCutter（http：//web.expasy.org/peptide_cutter/）進行胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K模擬水解，將水解得到的多肽整理分類，與BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep）數(shù)據(jù)庫中的DPP-Ⅳ抑制肽進行對比，篩選出合適的蛋白酶。

1.3.3 蛋白水解度的測定

在中性和堿性條件下，采用pH-Stat法[27]測定蛋白水解度。在水解反應(yīng)開始時，調(diào)節(jié)pH值為8.00，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)體系pH值，用0.50 mol/L NaOH溶液將反應(yīng)體系pH值再次調(diào)至8.00，記錄所用NaOH溶液體積，

按式（1）計算蛋白水解度。

（1）

式中：V為NaOH溶液所用體積/mL;c為NaOH溶液濃度/（mol/L）;1/T為2.26;m為蛋白質(zhì)質(zhì)量/g;htot為每克蛋白質(zhì)中所含肽鍵的物質(zhì)的量（8.30 mmol/g）。

1.3.4 DPP-Ⅳ抑制活性測定

采用熒光法，按照DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒說明書步驟操作，37 ℃孵育30 min，在激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長460 nm條件下檢測熒光強度。按式（2）計算DPP-Ⅳ抑制率。

（2）

式中：a為抑制劑孔熒光強度;b為背景孔熒光強度;c為DPP-Ⅳ孔熒光強度。

1.3.5 單因素試驗

選定最佳蛋白酶后，研究酶解時間、酶解溫度和加酶量對驢血紅蛋白水解度和DPP-Ⅳ活性抑制率的影響。

1.3.5.1 酶解時間對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、加酶量400 U/g、

酶解溫度60 ℃、pH 8，分別酶解1、2、3、4、5 h，以水解度和DPP-Ⅳ抑制率為指標，確定最適酶解時間。

1.3.5.2 酶添加量對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、pH 8、酶解時間3 h，分別考察加酶量為240、320、400、480、560 U/g時的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，確定最適加酶量。

1.3.5.3 酶解溫度對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100mL、蛋白酶K添加量480 U/g、pH 8、酶解時間3 h，分別考察酶解溫度50、55、60、65、70 ℃時的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，確定最適酶解溫度。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的工藝條件

以DPP-Ⅳ抑制活性率為指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用3因素3水平響應(yīng)面試驗，確定驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工藝條件。試驗因素水平見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每項測定均重復(fù)3 次，采用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert V8.0.6和SPSS 22軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢血紅蛋白純度檢測

由圖1可知，電泳只顯示一條蛋白質(zhì)條帶，說明該血紅蛋白的分子質(zhì)量均一，為典型的血紅蛋白SDS-PAGE圖像。

2.2 計算機模擬酶解驢血紅蛋白的結(jié)果

本研究分別使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K對驢血紅蛋白進行模擬酶解。由表2可知，使用胰蛋白酶水解得到25 種多肽，共25 條，其中二肽4 種，共4 條，在總多肽數(shù)量中的占比為16%，四肽4 種，共4 條，在總多肽數(shù)量中的占比為16%。使用胃蛋白酶水解得到52 種多肽，共52 條，其中二肽15 種，共15 條，在總多肽數(shù)量中的占比為46.90%;三肽13 種，共13 條，在總多肽數(shù)量中的占比為40.60%。使用木瓜蛋白酶得到72 種多肽，共76 條，其中二肽27 種，共31 條，在總多肽數(shù)量中的占比為28.88%，三肽24 種，共24 條，在總多肽數(shù)量中的占比為25%;使用蛋白酶K水解得到76 種多肽，共78 條，其中二肽35 種，共37條，在總多肽數(shù)量中的占比為47.40%;三肽31 種，共31 條，在總多肽數(shù)量中的占比為39.70%。模擬水解的結(jié)果表明，蛋白酶K理論上釋放的肽段數(shù)量和種類較多，酶解效果優(yōu)于其他蛋白酶。

由表3可知，將模擬酶解得到的多肽與BIOPEP數(shù)據(jù)庫進行對比發(fā)現(xiàn)，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K水解分別得到3、7、14、26 種已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽。因此，本研究選用蛋白酶K作為最佳蛋白酶進行后續(xù)實驗。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 酶解時間對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

小寫字母不同，表示水解度組間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示DPP-Ⅳ抑制率組間差異顯著（P<0.05）。圖3～4同。

由圖2可知，在酶解1～3 h內(nèi)，驢血紅蛋白水解度呈遞增趨勢（P<0.05），隨著酶解時間的延長，水解度稍有降低;這是因為隨著水解的進行，底物蛋白質(zhì)不斷減少，酶解產(chǎn)物逐漸積累，從而抑制酶解反應(yīng)的進行。DPP-Ⅳ抑制活性隨酶解時間的延長呈先上升后下降趨勢，在酶解3 h時達到最大，為54.75%，這與吉薇[28]使用動物蛋白酶水解南極磷蝦蛋白制備DPP-Ⅳ抑制肽的研究結(jié)果一致。這是因為隨著酶解時間延長，蛋白質(zhì)水解生成的肽含量增多，DPP-Ⅳ抑制率隨之增大，繼續(xù)水解導致底物的酶解程度過大，使得到的活性多肽進一步水解成氨基酸，多肽含量降低，活性肽的數(shù)量也隨之減少。

2.3.2 酶添加量對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

由圖3可知，酶添加量為240～480 U/g時，驢血紅蛋白水解度呈遞增趨勢（P<0.05），隨著酶添加量的增加，水解度變化幅度較小，曲線趨于平緩。抑制率DPP-Ⅳ隨酶添加量的增加呈先上升后下降趨勢，在480 U/g

時達到最大，為55.02%。這可能是因為酶添加量較小時，隨著酶量的增多，蛋白質(zhì)分解逐漸完全，DPP-Ⅳ抑制率和水解度也逐漸增大。當酶添加量達到480 U/g，此時酶分子相對于底物來說已趨向飽和，DPP-Ⅳ抑制率達到最大值，繼續(xù)增大酶添加量，蛋白分子水解完全導致具有DPP-Ⅳ抑制活性的多肽分子減少，DPP-Ⅳ抑制率降低，這與Nongonierma等[29]酶解制備DPP-Ⅳ抑制肽時的結(jié)論類似。

2.3.3 酶解溫度對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，驢血紅蛋白水解度和酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率均呈先升高后降低的趨勢，當酶解溫度為65 ℃時，二者均達到最大，繼續(xù)升高酶解溫度，DPP-Ⅳ抑制活性顯著下降（P<0.05）。推測隨著酶解溫度的升高，可能是由于蛋白酶K的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，從而影響酶解效果[30]，也可能是由于DPP-Ⅳ抑制肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使其活性下降。因此，選擇65 ℃為最適酶解溫度。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

通過Design-Expert V8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表4所示。得到回歸方程如下：Y=53.32+0.33A-0.20B+1.40C-1.72AB+1.33AC+1.60BC-2.32A2-5.10B2-2.76C2。對模型進行方差分析，由表5可知，該模型P<0.01，失擬項P=0.2482>0.05，不顯著，表明建模成功，模型回歸系數(shù)R2=0.953 1，說明模型擬合程度良好且差異具有統(tǒng)計學意義，該模型可用于確定驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工藝。對DPP-Ⅳ抑制率影響順序為C酶添加量>B酶解時間>A酶解溫度，模型中一次項C，交互項AB、BC，二次項A2、B2、C2對試驗結(jié)果有顯著影響（P<0.05或P<0.01）。

2.4.1 因素交互作用分析

在響應(yīng)面分析中等高線形狀越接近橢圓形和響應(yīng)面曲面傾斜度越陡，響應(yīng)值對于處理條件改變的敏感程度越大，顏色越深，表明因素間的交互作用顯著，反之則交互作用不顯著[31]。由圖5可知，3 種因素交互作用對DPP-Ⅳ抑制率影響較顯著。

2.4.2 模型驗證試驗

通過分析響應(yīng)面試驗結(jié)果，得到酶解驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳條件為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、酶解溫度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.80%。在最優(yōu)條件下進行驗證，測得此條件下DPP-Ⅳ抑制率為53.44%，接近于理論值，表明該模型可較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

3 結(jié) 論

食源性DPP-Ⅳ抑制肽的研究一般按照以下流程

進行[25，33]：1）選取合適的蛋白底物和酶;2）酶解蛋白;3）體外活性分析;4）富集/分離;5）DPP-Ⅳ抑制肽的鑒定;6）DPP-Ⅳ抑制效能驗證;7）抑制機制闡述;8）細胞及動物實驗驗證。該方法耗時且勞動強度大，對蛋白酶的選擇缺乏目的性[26]。本研究應(yīng)用計算機結(jié)合傳統(tǒng)酶解方法制備驢血紅蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，有效篩選出蛋白酶K為最佳蛋白酶，其水解所得多肽數(shù)量和種類最多，且獲得的已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽數(shù)量也最多，有效地減少了實驗過程中的盲目性。實際酶解結(jié)果表明，驢血紅蛋白酶解物具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性;在單因素試驗基礎(chǔ)上，以DPP-Ⅳ抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法研究酶解時間、酶解溫度和酶添加量對血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率的影響，確定蛋白酶K的最優(yōu)酶解工藝為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、酶解溫度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.44%，理論值與實測值基本相符。本實驗結(jié)果為驢血紅蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的制備和功能性研究提供了技術(shù)參考。

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