謝春芳，于瑞嵩，董世娟，陳冰清

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室，上海 201106)

非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV) 是一種雙鏈大DNA 病毒，目前是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae) 唯一的成員。非洲豬瘟病毒粒子直徑為250 nm～300 nm，基因組長(zhǎng)度為170 kb～194 kb；細(xì)胞內(nèi)ASFV 粒子直徑約200 nm，病毒基因組與核蛋白聚集成病毒核心，核心外包裹有蛋白核殼，核殼外包裹著脂質(zhì)內(nèi)膜，脂質(zhì)內(nèi)膜外是二十面體蛋白衣殼，最后通過(guò)出胞獲得病毒外膜，成為一個(gè)成熟完整的ASFV 粒子[1-5](圖1)。

ASFV 在環(huán)境中非常穩(wěn)定，在4 ℃血液中可保存一年以上，在肉制品中可保存數(shù)周。ASFV 可在蜱類和豬中高效復(fù)制，并在兩者之間循環(huán)傳播[6]。

ASFV 通過(guò)脫殼侵入細(xì)胞，病毒脫殼需要酸性環(huán)境破壞病毒的外膜和蛋白衣殼。在細(xì)胞的內(nèi)泡小體內(nèi)，病毒的外膜和二十面體蛋白衣殼被破壞，暴露出病毒內(nèi)膜，病毒內(nèi)膜與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，感染宿主細(xì)胞。ASFV 感染細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的“病毒工廠(Viral Factories，VFs)”中進(jìn)行復(fù)制[7]。

在早期核內(nèi)復(fù)制階段，ASFV 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核膜破裂并募集細(xì)胞S 期特異性翻譯因子——真核翻譯起始因子4E/4G(eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G，eIF4E/4G) 和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1，4E-BP1)到病毒工廠，以增強(qiáng)病毒復(fù)制能力，然后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行病毒DNA 復(fù)制和包裝[8-10]。

1 病毒核心

ASFV 粒子基因組和核蛋白形成病毒核心部分，ASFV pA104R 是組蛋白樣蛋白，屬于核蛋白，對(duì)染色體的扭曲、彎曲、折疊等拓?fù)湫揎棸l(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能，以增加核穩(wěn)定性。在ASFV 復(fù)制周期，pA104R 與DNA 的相互作用并結(jié)合非常重要。二苯乙烯衍生物(Stilbene Derivatives，SD)1 和SD4 能 破 壞pA104R 與DNA 的結(jié)合；pA104R 的β 鏈DNA 結(jié)合區(qū)(DNA Binding Region，DBR) 的堿基突變也會(huì)消除pA104R 與DNA 的結(jié)合，pA104R 未與DNA 結(jié)合的ASFV 不會(huì)進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制[11-16]。

病豬組織細(xì)胞中存在無(wú)病毒核心的ASFV粒子，說(shuō)明ASFV 粒子先完成病毒內(nèi)膜、衣殼的裝配，然后形成病毒核心基因組與核蛋白完成裝配[17-18]。

2 核殼

核殼位于含DNA 的核仁和內(nèi)膜之間，是一個(gè)類似基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，包裹著核心。ASFV 核殼是一層30 nm 厚的蛋白層，主要由多聚蛋白pp220 和pp62 的加工產(chǎn)物構(gòu)成。pp220 和pp62 的加工都依賴于主要衣殼蛋白p72 的表達(dá)，pp62 的加工還需要pp220 前體的表達(dá)，pp220 和pp62 能夠相互作用形成核殼狀結(jié)構(gòu)，這幾乎占病毒總質(zhì)量的三分之一。多聚蛋白加工是一個(gè)成熟的過(guò)程，伴隨著核心組裝，多聚蛋白pp220 和pp62 被S273R基因編碼的半胱氨酸蛋白酶催化，通過(guò)共有基序Gly-Gly-X 有序水解成蛋白，pp220 水解產(chǎn)生p150、p37、p34 和p14，pp62 的主要水解產(chǎn)物是p35 和p15。p150、p37、p34、p14、p35 和p15 形 成ASFV 粒子的幾個(gè)主要成分，構(gòu)成病毒核殼[19-23]。

3 內(nèi)膜

ASFV 內(nèi)膜從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜衍生而來(lái)，依賴病毒p54，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是病毒內(nèi)膜的前體，內(nèi)膜凸面上逐漸形成二十面體衣殼，內(nèi)膜凹面上同時(shí)形成核殼[7]。

pE248R 是ASFV 內(nèi)膜上的跨膜肽，在病毒外膜和蛋白衣殼破壞后，pE248R 與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，感染宿主細(xì)胞[2]。

在幾種病毒感染中，脂質(zhì)是形成VFs 的基礎(chǔ)，病毒利用膜接觸位點(diǎn)(Membrane Contact Sites，MCSs) 確保脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到VFs，MCSs具有提供能量轉(zhuǎn)移其他脂類的功能，如磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phosphatidylinostol-4-Phosphate，PI4P)。PI4P 在哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum，ER)-高爾基體MCSs 中由磷脂酰肌醇-4-磷酸-激酶Ⅳβ 與一些同功酶如磷脂酰肌醇-4-激酶β(Phosphatidylinostol-4-Kinasesβ，PI4Kβ) 或磷脂酰肌醇-4-激 酶 Ⅱβ(Phosphatidylinostol-4-Kinases Ⅱβ，PI4K Ⅱβ) 局部產(chǎn)生。PI4P 負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合/ 轉(zhuǎn)移蛋白氧化淄醇蛋白(Oxysterol Binding Protein，OSBP) 與 高爾基體對(duì)接。MCSs 中的駐留分子允許細(xì)胞器之間的非囊泡脂質(zhì)和離子交換，OSBP 將膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在高爾基體中聚集，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)PI4P。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中PI4P 的水解為這一過(guò)程提供能量。一些研究表明，MCSs機(jī)制和PI4P 依賴的固醇穿梭蛋白參與了病毒復(fù)制。病毒會(huì)招募一個(gè)宿主PI4P 激酶在其復(fù)制細(xì)胞器中富集PI4P。在所有的情況下，PI4P脂質(zhì)都會(huì)促使OSBP 進(jìn)入VFs，導(dǎo)致ER 和VFs之間形成MCSs，在該MCSs 中，膽固醇/PI4P交換驅(qū)動(dòng)膽固醇在復(fù)制位點(diǎn)的積聚[24-26]。

ASFV pE199L 是一種富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)多肽，定位于病毒的內(nèi)膜，具有細(xì)胞溶質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵。pE248R 是ASFV 內(nèi)膜上的另一個(gè)跨膜肽，pE248R 和pE199LR 與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，形成ASFV 進(jìn)入細(xì)胞的一種融合機(jī)制，感染宿主細(xì)胞[7,27]。

p17 是由三個(gè)連續(xù)α 螺旋組成的蛇形結(jié)構(gòu)，p17 與外衣殼蛋白p72 結(jié)合，緊密連接ASFV 病毒內(nèi)膜與外衣殼，穩(wěn)定病毒的外衣殼結(jié)構(gòu)與形成[28]。

4 衣殼

ASFV 粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，由50 多種衣殼蛋白組裝完成，二十面體結(jié)構(gòu)在被感染的巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)接近核附近微管組織中心(microtubule organization center)的VFs區(qū)域內(nèi)組裝形成。p72 是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，屬病毒晚期表達(dá)的蛋白，完成一個(gè)病毒粒子的衣殼裝配需要8 280 多個(gè)p72，此外還需p17、M1249L、p49 和H240R，其均為輔助蛋白[3,28]。

p72 以同源三聚體連接，每個(gè)單體呈雙膠卷形態(tài)，使p72 三聚體看起來(lái)像一個(gè)六聚體，稱為“偽六聚體”(pseudo-heameric capsomers)，每一個(gè)卷含有8個(gè)反向平行的β 鏈結(jié)構(gòu)，并有4 個(gè)暴露在外的環(huán)D1E1、D2E2、F1G1 和H1I1 暴露域(Exposed Regions，ERs)。這些ERs 與N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal Domain，NTD) 決定了病毒不同型之間的特異性差異，這與許多病毒衣殼蛋白相似。輔助蛋白p17 是一種非常重要且非常豐富的蛋白，是內(nèi)膜蛋白也是衣殼蛋白，是病毒衣殼組裝和二十面體形成必需的蛋白。p17 的胞外域與p72 的殘基結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，將p72帽狀體牢固地錨定在內(nèi)膜上。5 個(gè)penton 蛋白組成一個(gè)五聚體，骨架蛋白M1249L 黏附到五聚體核心，將帽狀體連接在一起，不僅形成了一個(gè)五邊體，而且連接了兩個(gè)相鄰的五邊體形成骨架，使五聚體核心與p17 可以在內(nèi)膜上移動(dòng)，并與其他衣殼蛋白形成廣泛的分子間網(wǎng)絡(luò)，從而推動(dòng)衣殼框架的形成。M1249L 長(zhǎng)100 nm，作為衣殼對(duì)稱三邊體的邊連接2 個(gè)對(duì)稱的五邊體，衣殼蛋白p49(B438L)是形成衣殼頂點(diǎn)所必需的。p49 是一種完整的膜蛋白，它不參與病毒粒子從病毒組裝點(diǎn)到質(zhì)膜的運(yùn)輸。p72 三聚體、penton 五聚體在p17、p49與M1249L 的作用下形成衣殼的對(duì)稱三邊體和五邊體，20 個(gè)對(duì)稱三邊體和12 個(gè)對(duì)稱五邊體構(gòu)成了病毒的外衣殼[3，28-33]。

H240R 有240 個(gè)殘基，富含β 鏈，不同于p72，但與p72 同源，具體結(jié)構(gòu)還不清楚；在外衣殼的內(nèi)膜面，還有許許多多未知的小衣殼蛋白[3，28，33]。

衣殼組裝依賴于衣殼蛋白p72 和p49(B438L) 的表達(dá)以及病毒伴侶蛋白B602L的表達(dá)。靜電力在病毒衣殼的組裝過(guò)程中起著重要的作用，引導(dǎo)著衣殼小體在合適的距離和方向上相互作用，維持穩(wěn)定的組裝。組裝外衣殼蛋白的ASFV 粒子直徑約200 nm[34]。

5 外包膜

ASFV 粒子在細(xì)胞質(zhì)的VFs 中沒(méi)有外包膜，只形成四層結(jié)構(gòu)，即病毒核心、核殼、內(nèi)膜和衣殼。VFs 中形成的ASFV 粒子在出芽時(shí)通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜獲得病毒外膜，從而成為一個(gè)成熟的病毒，其直徑為250 nm～300 nm。當(dāng)ASFV粒子移動(dòng)到酸性環(huán)境時(shí)，病毒通過(guò)質(zhì)膜發(fā)芽獲得的外膜就消失了[2，3，35-36]。

6 小結(jié)

非洲豬瘟從發(fā)現(xiàn)至今已有近100 年的歷史，給養(yǎng)豬業(yè)及人類社會(huì)的公共環(huán)境帶來(lái)了非常嚴(yán)重的危害，對(duì)ASFV 的研究越深入，根除ASF 的目標(biāo)就越近，通過(guò)各種電鏡和分析技術(shù)，我們正在逐漸剝開(kāi)ASFV 包裹著的一層又一層膜和蛋白，相信無(wú)ASFV 的這一天一定會(huì)到來(lái)。