夏學(xué)敏 張 霞 翁儀瑾 張 壘 唐如意

(上海工程技術(shù)大學(xué)材料工程學(xué)院，上海 201620)

0 引 言

表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)以其超高的靈敏度和無損檢測的特點，已經(jīng)在表面科學(xué)、分析化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-4]。傳統(tǒng)的SERS基底仍然是金、銀、銅等貴重金屬材料，然而其制作成本高、過程復(fù)雜且重復(fù)性差，所以出現(xiàn)了一些特殊制備的金屬納米材料，也可以作為拉曼基底，例如，F(xiàn)e3O4納米顆粒[5-6]、MnO2納米薄片[7]和 SiO2納米粒子[8]等。

目前，葡萄糖的檢測方法有很多，例如熒光法[9]、分光光度法[10]、層析法[11]、電分析法[12]等。張玲玲課題組[13]發(fā)現(xiàn)TiO2納米管陣列具有過氧化物酶活性，偶聯(lián)葡萄糖氧化酶(GOx)可以測定葡萄糖，線性范圍為4×10-4～3.6×10-3mol·L-1。王炎課題組[14]制備出具有過氧化物酶活性的二維(2D)Ni基金屬-有機骨架(MOF)納米片，得到了檢測人體血清中葡萄糖的納米傳感器。但上述方法存在制備方法復(fù)雜、靈敏度不高、檢測極限有限等缺點，拉曼光譜法具有檢測時間短、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點。經(jīng)拉曼光譜法得到的信號峰尖銳、特征明顯且樣品制備過程簡單，并且可以在30 s內(nèi)，較低濃度下獲得每個樣品顯著的SERS信號。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米酶(也稱類酶納米材料)由于制備過程更容易、成本更低、穩(wěn)定性更強、催化活性更高，實現(xiàn)了在分析化學(xué)、催化和癌癥治療等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，成為了天然酶的替代品。然而，已報道的納米酶通常局限于有限種類的酶活性，如類過氧化物酶[15-17]和類超氧化物歧化酶活性[18-20]等。同時具有類過氧化物酶和類葡萄糖氧化酶活性的“串聯(lián)酶”最早被韓磊的課題組[21]提出，他們將“非裸”的Au NPs定義為“串聯(lián)酶”。

基于以上原因，我們制備了一種金屬氧化物納米粒子作為拉曼基底實現(xiàn)葡萄糖的微量檢測。通過簡單的濕化學(xué)法合成了Co3O4納米顆粒(NPs)，驗證了其類過氧化物酶活性和“串聯(lián)酶”活性并進行“串聯(lián)酶”的優(yōu)化，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件使其達到最佳活性，最后通過拉曼散射光譜分析了葡萄糖的含量。單一Co3O4納米酶極大地促進了催化過程和產(chǎn)物的生成。

1 實驗部分

1.1 試劑

六水氯化鈷(CoCl2·6H2O)、硼氫化鈉(NaBH4)購自中國上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司。牛血清蛋白(BSA)購自Salarbio(北京)。3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫(H2O2，30%)、甘氨酸-HCl緩沖液(pH=2.0～3.0)、醋酸鈉緩沖液(pH=4.0～5.0)和磷酸鹽緩沖液(pH=6.0～7.0)均取自上海阿拉丁生化科技有限公司。所有化學(xué)品均未經(jīng)進一步凈化而直接使用。

1.2 儀器

采用掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S4800)對樣品的形貌尺寸進行表征，其主要技術(shù)參數(shù)：二次電子成像分辨率為1.0 nm@15 kV、加速電壓0.1～30 kV。采用X射線衍射(XRD，Rigaku Ultima Ⅳ)對樣品的物相結(jié)構(gòu)進行表征，其主要技術(shù)參數(shù)：工作電壓40 kV、輻射源CuKα靶、波長0.154 nm、掃描范圍20°～80°。采用 X 射線光電子能譜(XPS，Thermo Scientific K-Alpha)對樣品的物質(zhì)成分進行表征，其主要技術(shù)參數(shù)：離子槍能量范圍100～4 000 eV、180°雙聚集半球分析。采用HORIBA集團生產(chǎn)的拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution)對樣品進行SERS分析，其主要技術(shù)參數(shù)：全波長范圍200～2 000 nm、波數(shù)范圍50～9 000 cm-1、光譜分辨率 1 cm-1，激發(fā)光波長為633 nm。

1.3 Co3O4 NPs的合成

采用濕化學(xué)法制備了Co3O4NPs。首先，800 μg BSA 與 1 mL CoCl2·6H2O 水溶液(5×10-3mol·L-1)在25 ℃下培養(yǎng)1 h。然后，將1 mL NaBH4(1×10-2mol·L-1)添加到上述混合溶液。在NaBH4還原Co2+的作用下，以BSA為穩(wěn)定劑形成灰色Co，新生成的Co在空氣中自發(fā)氧化為穩(wěn)定的黑色Co3O4[22-23]。放置12 h后，離心，收集BSA模板化的Co3O4NPs，用水洗凈，4℃保存。取一定量Co3O4NPs固體顆粒配成濃度為20 mg·L-1的水溶液備用。

1.4 類過氧化物酶活性的測定

Co3O4NPs的類過氧化物酶活性按以下步驟進行：首先，取4個小試管依次加入5 μL Co3O4NPs、10 μL H2O2(30%)、10 μL TMB 和 30 μL NaAc 緩沖液(pH=4.0)；10 μL TMB、10 μL H2O2和 30 μL NaAc 緩沖液；5 μL Co3O4NPs、10 μL H2O2和 30 μL NaAc緩沖液；30 μL NaAc緩沖液。上述4種混合溶液在充分反應(yīng)后，離心，上清液被快速轉(zhuǎn)移到毛細管中，通過SERS進行測量。其次，在含有10 μL TMB的30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)中，加入一系列不同濃度(1～10-9mol·L-1)的 H2O2溶液、5 μL Co3O4NPs和 10 μL TMB，轉(zhuǎn)移到毛細管中后，仍然通過SERS進行測量。采用不同pH值(2.0～7.0)的緩沖溶液研究pH對Co3O4NPs催化活性的影響。在10～80℃之間研究溫度對類過氧化物酶活性的影響。

1.5 “串聯(lián)酶”活性的測定

在小試管中先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再加入 10 μL TMB、10 μL 不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)的葡萄糖溶液和 5 μL Co3O4NPs。讓上述混合物在常溫(25℃)下充分反應(yīng)，離心，然后將上清液快速轉(zhuǎn)移到毛細管中，通過SERS進行測量。采用不同pH值(2.0～7.0)的緩沖溶液研究pH對Co3O4NPs催化活性的影響。在10～80℃之間研究溫度對“串聯(lián)酶”活性的影響。

1.6 葡萄糖的檢測

對于葡萄糖的定量分析，在小試管中先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再加入10 μL TMB、10 μL不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)的葡萄糖溶液和 5 μL Co3O4NPs。讓上述混合物在常溫(25℃)下充分反應(yīng)，離心，然后將上清液快速轉(zhuǎn)移到毛細管中，通過SERS進行測量。然后通過線性擬合繪制校準(zhǔn)曲線。另外驗證了其他糖對葡萄糖檢測的干擾：準(zhǔn)備5個小試管，先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再分別加入10 μL濃度為10-2mol·L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、麥芽糖和 10 μL TMB、5 μL Co3O4NPs，通過SERS進行測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Co3O4 NPs的表征

通過SEM觀察Co3O4NPs的形態(tài)(圖1a、1b)。如圖1所示，所制備的Co3O4NPs接近塊狀并且高度分散。為了進一步研究Co3O4NPs的化學(xué)組成，通過EDS光譜檢測Co3O4NPs。圖1c顯示該材料由Co、O兩種元素組成。圖1d為Co3O4NPs的XRD圖，由圖可知，除了在24°歸屬于基底碳布的較強峰外，各衍射峰的位置與 Co3O4立方晶系的(111)、(220)、(311)、(400)、(511)、(440)晶面相對應(yīng)，與 Co3O4的標(biāo)準(zhǔn)圖(PDF No.42-1467)相吻合，圖中少量雜峰的出現(xiàn)說明合成的材料純度較高。利用XPS表征了Co3O4納米顆粒的表面組成，圖1e的全譜圖也表明Co、O元素的存在，圖1f、1g分別為O1s和Co2p的高分辨XPS譜圖，其中Co2p譜圖中的2個主峰794.9和779.8 eV分別對應(yīng)Co3O4的Co2p1/2和Co2p3/2自旋軌道峰[24]。以上結(jié)果說明Co3O4NPs被成功制備。

圖1 Co3O4 NPs的SEM圖 (a、b)、EDS譜圖 (c)、XRD圖 (d)和XPS譜圖 (e～g)Fig.1 SEM images(a,b),EDS spectrum(c),XRD pattern(d)and XPS spectra(e～g)of Co3O4 NPs

2.2 Co3O4 NPs的類過氧化物酶活性

為了驗證Co3O4NPs的類過氧化物酶活性，我們構(gòu)建了一個NPs-H2O2-TMB反應(yīng)體系，該體系以H2O2、NaAc緩沖液和TMB為底物進行催化反應(yīng)。在H2O2存在的條件下，Co3O4NPs能夠催化TMB氧化生成藍色產(chǎn)物氧化TMB(oxTMB)。如圖2a所示，僅NPs-H2O2-TMB反應(yīng)體系的溶液顏色變成藍色，而對照組未發(fā)生顏色反應(yīng)，說明僅在NPs-H2O2-TMB反應(yīng)體系中才能產(chǎn)生大量的oxTMB，使得溶液變色。圖2b中在1 188、1 330和1 610 cm-1處均檢測到明顯的SERS信號，這是由oxTMB引起的。其中，SERS信號中1 188 cm-1處拉曼峰對應(yīng)于CH3的彎曲振動峰，1 330 cm-1處拉曼峰對應(yīng)于苯環(huán)內(nèi)的C—C伸縮振動峰，1 610 cm-1處拉曼峰對應(yīng)于苯環(huán)的伸縮縫和C—H伸縮振動峰[25]。因此，這3個拉曼峰均可用于NPs-H2O2-TMB反應(yīng)體系的分析。通過4種不同反應(yīng)體系的SERS光譜可知，曲線Ⅰ和Ⅱ上有較強的拉曼峰，曲線Ⅲ和Ⅳ上有微弱的峰或無峰，說明真正參與反應(yīng)的是TMB和H2O2；曲線Ⅰ上oxTMB的拉曼峰比曲線Ⅱ的強，說明是Co3O4NPs起催化作用；曲線Ⅲ上有微弱的拉曼峰，說明TMB在空氣中有一部分發(fā)生自然氧化；曲線Ⅳ上無拉曼峰，說明NaAc起的是緩沖液的作用。因此在反應(yīng)體系中的催化反應(yīng)是由TMB、H2O2和Co3O4NPs的共催化作用引起。綜上證明了Co3O4NPs具有類過氧化物酶活性。

圖2 (a)不同反應(yīng)體系的顏色照片和(b)不同反應(yīng)體系的SERS光譜Fig.2 (a)Visual photograph and(b)SERS spectra of different reaction systems

在NPs-H2O2-TMB反應(yīng)體系引入一系列濃度梯度(1～10-9mol·L-1)的H2O2溶液。如圖3所示，H2O2的濃度越高，oxTMB的3個特征峰的SERS信號越強。當(dāng)H2O2濃度低至10-9mol·L-1時仍然有明顯的SERS信號，這表明了Co3O4NPs具有良好的類過氧化物酶活性。目前，基于這一反應(yīng)體系的檢測方法有很多，例如紫外分光光度法[26]，但待檢測物在較低濃度(1×10-6mol·L-1)下沒有明顯的吸收峰，而拉曼光譜法具有更高的靈敏度以及檢測限低的優(yōu)點。

2.3 Co3O4 NPs的“串聯(lián)酶”活性

為了驗證Co3O4NPs的“串聯(lián)酶”活性，我們構(gòu)建了一個NPs-葡萄糖-TMB的反應(yīng)體系，該體系是由Co3O4NPs、葡萄糖、NaAc緩沖液和TMB組成。整個反應(yīng)過程包括2個步驟：

首先，Co3O4NPs催化葡萄糖與空氣中的O2生成葡萄糖酸和H2O2，如式(1)所示：

其次，Co3O4NPs催化H2O2和TMB生成H2O和oxTMB，如式(2)所示。

我們研究發(fā)現(xiàn)Co3O4NPs在第一步中表現(xiàn)出類葡萄糖氧化酶的活性，在第二步中表現(xiàn)出類過氧化物酶的活性，且在第一步中產(chǎn)生的H2O2可以引發(fā)第二步的類過氧化物酶活性的催化反應(yīng)。與以往的葡萄糖分析方法相比，這個反應(yīng)體系不添加H2O2就可以促進檢測過程。如圖4所示，在不存在H2O2的反應(yīng)體系中，仍然可以在1 188、1 330和1 610 cm-1處檢測到oxTMB的SERS信號。在Co3O4NPs催化作用下，由于葡萄糖濃度的增加，可以生成大量的H2O2進而促進TMB的氧化，所以oxTMB的3個特征峰的強度逐漸增大，由此可以證明Co3O4NPs具有“串聯(lián)酶”活性，而且當(dāng)葡萄糖濃度低至10-10mol·L-1時也存在明顯的SERS信號，這表明了Co3O4NPs具有良好的“串聯(lián)酶”活性[21]。

圖4 在NPs-葡萄糖-TMB體系中不同濃度的葡萄糖對oxTMB的SERS光譜的影響Fig.4 Effect of different concentrations of glucose on the SERS spectra of oxTMB in NPs-glucose-TMB system

2.4 納米酶活性的優(yōu)化

眾所周知，納米酶已經(jīng)逐漸成為替代天然酶的熱門材料。但納米酶的活性仍然受pH和溫度的影響。因此，為了進一步優(yōu)化Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯(lián)酶”活性，我們分別研究了實驗條件變化對Co3O4NPs“串聯(lián)酶”活性的影響。首先，優(yōu)化實驗中的pH。圖5a是不同pH值(2.0～7.0)下NPs-H2O2-TMB體系的SERS信號強度，圖中最高點對應(yīng)最佳pH值時的拉曼強度，其對應(yīng)樣品的相對活性為100%。通過對比發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的增加，SERS強度在pH=2.0～4.0的范圍內(nèi)增加，然后在pH=4.0～7.0的范圍內(nèi)降低。值得注意的是，對于類過氧化物酶活性，基于NPs-H2O2-TMB體系的Co3O4NPs在pH=4.0的條件下顯示出最高的類過氧化物酶活性(圖5b)，但在pH=3.8～4.5時仍保持90%的活性。而對于“串聯(lián)酶”活性，在pH=4.0的NaAc緩沖液中，基于NPs-葡萄糖-TMB體系，pH=4.0時Co3O4NPs顯示出最高的“串聯(lián)酶”活性。綜上可知，Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯(lián)酶”活性的最佳pH值一致。

圖5 納米酶活性的pH優(yōu)化:NPs-H2O2-TMB體系中(a)不同pH值下類過氧化物酶活性的SERS光譜和(b)Co3O4 NPs在不同pH值下類過氧化物酶活性的相對強度;NPs-葡萄糖-TMB體系中(c)不同pH值下“串聯(lián)酶”活性的SERS光譜和(d)Co3O4 NPs在不同pH值下“串聯(lián)酶”活性的相對強度Fig.5 pH optimization of nano-enzyme activity:(a)SERS spectra of peroxidase-like activity at different pH values and(b)relative strength of peroxidase-like activity of Co3O4 NPs at different pH values in NPs-H2O2-TMB system;(c)SERS spectra of“tandem enzyme”activity at different pH values and(d)relative strength of“tandem enzyme”activity at different pH values in the NPs-glucose-TMB system

其次，研究了不同溫度(10～80℃)下Co3O4NPs的活性。對于類過氧化物酶活性，基于NPs-H2O2-TMB體系，當(dāng)溫度為60℃時顯示出最高的類過氧化物酶活性(圖6a、6b)。對于“串聯(lián)酶”活性，基于NPs-葡萄糖-TMB體系，在pH=4.0的NaAc緩沖液中，當(dāng)溫度為60℃時顯示出最高的“串聯(lián)酶”活性(圖6c、6d)。類過氧化物酶和“串聯(lián)酶”活性在10～60℃的溫度范圍內(nèi)升高，而在60℃以上時降低。與類過氧化物酶活性不同的是，“串聯(lián)酶”在50～65℃范圍內(nèi)可以保持80%的活性。根據(jù)以上結(jié)果可知，Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯(lián)酶”活性的最佳溫度一致。

圖6 納米酶活性的溫度優(yōu)化:NPs-H2O2-TMB體系中(a)在不同溫度下類過氧化物酶活性的SERS光譜和(b)不同溫度下Co3O4 NPs類過氧化物酶活性的相對強度;NPs-葡萄糖-TMB體系中(c)在不同溫度下“串聯(lián)酶”活性的SERS光譜和(d)不同溫度下Co3O4 NPs“串聯(lián)酶”活性的相對強度Fig.6 Temperature optimization of nano-enzyme activity:(a)SERS spectra of peroxidase-like activity at different temperatures and(b)relative strength of peroxidase-like activity of Co3O4 NPs at different temperatures in NPs-H2O2-TMB system;(c)SERS spectra of“tandem enzyme”activity at different temperatures and(d)relative intensity of“tandem enzyme”activity at different temperatures in the NPs-glucose-TMB system

2.5 葡萄糖的檢測

基于Co3O4NPs的“串聯(lián)酶”活性，我們提出了一種新的應(yīng)用于葡萄糖檢測的SERS策略。在NPs-葡萄糖-TMB的體系中進行Co3O4NPs與不同濃度葡萄糖的催化反應(yīng)。插圖為NPs-葡萄糖-TMB的體系中含有不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)葡萄糖的溶液，可以明顯地觀察到反應(yīng)溶液的顏色呈現(xiàn)從深到淺的規(guī)則變化。將圖7a中的3條線進行線性擬合得到圖7b～7d，對比發(fā)現(xiàn)圖7b中1 610 cm-1的SERS強度與葡萄糖濃度具有最佳的線性關(guān)系，其回歸方程為y=398.28x+3 969(R2=0.990 4)，線性范圍為 10-10～10-2mol·L-1，檢測限(LOD)為 10-10mol·L-1。由此，證明了該方法的可行性。此外，基于Co3O4納米顆?！按?lián)酶”活性檢測葡萄糖的SERS策略所用的響應(yīng)時間為30 s，而已報道的基于金納米顆粒的無酶分析方法[25]的響應(yīng)時間要在7 h以上，顯然，我們的檢測方法所用的響應(yīng)時間更短，這表明Co3O4NPs有成為一種新的葡萄糖傳感器的巨大潛力。

圖7 (a)oxTMB的SERS強度隨葡萄糖濃度變化折線圖,插圖顯示了葡萄糖濃度從高到低時的反應(yīng)產(chǎn)物oxTMB的視覺效果圖;(b)1 610 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線;(c)1 330 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線;(d)1 188 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線Fig.7 (a)Broken line graph of SERS intensity of oxTMB changing with glucose concentrations,the inset shows a visual rendering of the reaction product oxTMB changing with glucose concentrations from high to low;(b)Calibration curve for glucose detection at 1 610 cm-1;(c)Calibration curve for glucose detection at 1 330 cm-1;(d)Calibration curve for glucose detection at 1 188 cm-1

另外，我們驗證了其他糖對葡萄糖的干擾。如圖8所示，與存在葡萄糖的反應(yīng)體系中的SERS信號強度相比，存在蔗糖、半乳糖、木糖或麥芽糖的反應(yīng)體系中的SERS信號強度較小，說明此方法具有良好的選擇性。

圖8 相同濃度葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、麥芽糖在不同反應(yīng)體系中oxTMB的SERS光譜Fig.8 SERS spectra of oxTMB in the different reaction systems with the same concentration of glucose,sucrose,galactose,xylose and maltose

3 結(jié) 論

綜上所述，我們利用BSA作為生物模板，采用濕化學(xué)法合成了Co3O4NPs。制備的Co3O4NPs既具有類過氧化物酶活性，又具有“串聯(lián)酶”活性(類過氧化物酶和類葡萄糖氧化酶活性)。而且在相同的pH和溫度范圍內(nèi)，Co3O4NPs顯示出最佳的串聯(lián)酶活性。在此基礎(chǔ)上，利用Co3O4NPs的“串聯(lián)酶”活性，結(jié)合SERS光譜，提出了一種檢測葡萄糖的新策略。這一方法具有靈敏度高、檢測極限低、準(zhǔn)確度高和對真實樣品分析的可靠性好等特點，不僅為BSA定向合成金屬納米材料(Co3O4NPs)提供了新的途徑，更拓寬了納米酶的種類，而且還可以促進納米酶與抗原、抗體、熒光探針等分子的功能化，在免疫檢測、生物傳感器、醫(yī)療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。