孫 瑩，王 萌，王靖雷，孫曉軍，馬 睿，余四九，潘陽陽*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730050）

細(xì)胞色素P450（CytochromeP450，CYP450）是可以自身氧化的亞鐵血紅蛋白家族，該家族成員覆蓋了所有生物體，主要分布于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是內(nèi)、外源性物質(zhì)及致癌性物質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與生物體內(nèi)甾醇類激素合成的過程[1,2]。有研究表明，在女性生長發(fā)育過程中，缺乏細(xì)胞色素P450氧化還原酶會引起成年女性月經(jīng)紊亂，甚至出現(xiàn)不孕現(xiàn)象[3]。哺乳動物卵巢的每個生理周期均會排出處于成熟階段的卵泡用于受精，卵巢對雌性動物的生殖能力起決定性作用。由此可見，提高卵巢生理功能是目前研究的重點目標(biāo)。

CYP11A1作為細(xì)胞色素P450家族的成員，參與催化生物轉(zhuǎn)化、生物合成的過程[4]。在分子水平上，細(xì)胞色素P450CYP11A1通過裂解膽固醇側(cè)鏈，催化合成類固醇激素的前體——孕烯醇酮（Pregnenolone），促進(jìn)卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞的成熟[5,6]。有研究表明：CYP11A1的酶活性會受到雌激素、孕酮的調(diào)控，如雌二醇會影響孕烯醇酮的形成，具有促進(jìn)卵巢發(fā)育、排卵的功能，與動物生長繁殖也密切相關(guān)[3][7,8]。

牦牛（Bos grunniens）是中國以青藏高原為中心的珍稀牛種之一[9,10]。它在低溫高海拔、紫外線強的生態(tài)環(huán)境中生存，為牧民提供皮毛、牛奶、肉制品等多種生物制品，創(chuàng)造了極大的經(jīng)濟價值。但牦牛生產(chǎn)性能較低，90%以上的雌性牦牛產(chǎn)后同年無法發(fā)情，三年兩胎，甚至兩年一胎，生產(chǎn)過程極具局限性[11,12]。前有研究證明CYP11A1對家禽、藏豬、小尾寒羊等多種動物的生殖生理均有所影響，但在牦牛中未見報道[13,14]。因此，本研究以牦牛不同發(fā)育階段的卵泡、COCs為模型，應(yīng)用qRT-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測CYP11A1的表達(dá)水平及位置分布，為進(jìn)一步了解哺乳動物、反芻動物生殖生理的特異性奠定了基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS）購自Sigma公司（美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于PAN公司（澳大利亞）；TransZol RNA提取試劑盒（TransGen，北京）；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（艾科瑞生物，湖南）；SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒（寶生物，大連）；CYP11A1 Antibody（親科生物，常州）、免疫熒光檢測試劑購于南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

2020年8—12月從青海省西寧市馬佳肴屠宰場采集牦牛卵巢，置于裝有35℃生理鹽水（含青鏈霉素）的保溫壺中，4 h內(nèi)帶回實驗室。37℃生理鹽水（含青鏈霉素）清洗3遍，用帶有18G針頭的注射器抽取卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液，然后與提前37℃恒溫箱內(nèi)平衡的采卵液（D-PBS＋5%FBS）混勻；混合后的采卵液倒入50 mm培養(yǎng)皿中，靜置后在體視顯微鏡下?lián)炻?，并將卵移入裝有37℃采卵液的培養(yǎng)皿中清洗3次，再轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞成熟的培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別收集未成熟卵母細(xì)胞（0 h）、成熟12 h、成熟18 h的卵母細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞（24 h）各40枚，將每個階段收集的40枚卵母細(xì)胞分為2份，一份用于提取RNA，-80℃保存，另一份置于固定液用于后續(xù)免疫熒光染色。

1.3 牦牛COCs及卵泡液RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TransZol RNA提取試劑盒說明書提示，分別提取不同成熟階段（0 h、12 h、18 h和24 h）COCs的RNA，且分別在卵泡大小為0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm和＞8 mm時提取卵泡液的RNA，再利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ?qū)⑵溥M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)的cDNA，分別存于-20℃，用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

1.4 引物設(shè)計

參考GenBank上所公布的牛的CYP11A1基因序列（NM_176644.2），使用軟件Primer 5 設(shè)計引物，并將肌動蛋白β-Actin基因（DQ838049.1）設(shè)為內(nèi)參基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，詳細(xì)信息及反應(yīng)條件見表1。

表1 CYP11A1引物信息

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測CYP11A1基因的相對表達(dá)量

使用LightCycler?96 SW 1.1（Roch，Switzerland）實時熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μl（500 ng/μl），上、下游引物各0.5μl（0.2 μmol/ml），2*SYBR Green PCRmix 10 μl，補加ddH2O 8 μl使體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s、退火10 s（具體溫度見表1）、72℃延伸10 s，重復(fù)共40個循環(huán)，建立4個重復(fù)，β-Actin為內(nèi)參，根據(jù)熔解曲線確定反應(yīng)特異性，利用所得每個樣品的循環(huán)閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt法分析qRT-PCR所得數(shù)據(jù)，檢測CYP11A1基因的相對表達(dá)量。

1.6 免疫熒光染色技術(shù)檢測CYP11A1的表達(dá)定位

采用免疫熒光染色對COCs的CYP11A1蛋白進(jìn)行定位檢測，首先對在4℃用4%多聚甲醛固定后的細(xì)胞進(jìn)行通透處理，使用免疫封閉液孵育1 h，再用CYP11A1抗體4℃孵育過夜，清洗3遍后與二抗孵育結(jié)合，再清洗3遍使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，最后清洗3遍后封片鏡驗，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（oneway，ANOVA），每組至少重復(fù)3遍以上，所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Graphpad prism 7繪制柱狀圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 驗證CYP11A1引物特異性

2.1.1 核酸電泳檢測引物特異性 已知CYP11A1、β-Actin PCR產(chǎn)物大小分別為273bp、143bp，以卵泡液、COCs反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴增，驗證引物特異性。結(jié)果如圖1所示，片段大小與預(yù)期一致，條帶成像清晰，無非特異性結(jié)合片段，證明該引物特異性良好，可用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

2.1.2 CYP11A1擴增所得熔解曲線的結(jié)果 如圖2所示，通過qRT-PCR擴增，CYP11A1所得產(chǎn)物的熔解曲線是單峰，且出峰位置即為退火溫度。由此可見，該引物特異性及模板質(zhì)量均良好。

圖1 CYP11A1在卵泡液和卵母細(xì)胞中表達(dá)的核酸電泳結(jié)果

圖2 qRT-PCR檢測CYP11A1擴增所得熔解曲線的結(jié)果

圖3 CYP11A1在不同發(fā)育階段的卵泡液及COCs中的表達(dá)

2.2 qRT-PCR檢測結(jié)果

qRT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示，CYP11A1在卵泡及COCs發(fā)育的各時期均有表達(dá)。在卵泡液中，相對表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，在卵泡大小為3～5 mm時，表達(dá)量最高；而在COCs中，0 h時CYP11A1的相對表達(dá)量最低，12 h時相對表達(dá)量達(dá)到最高值，之后又呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。

2.3 免疫熒光染色檢測結(jié)果

圖4 蛋白CYP11A1在不同發(fā)育時期的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中的分布

對不同發(fā)育時期的COCs（0 h、12 h、18 h、24 h）進(jìn)行免疫熒光染色處理后，結(jié)果如圖4所示，不同時期COCs的卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞均表達(dá)CYP11A1，其中在成熟18 h的COCs放射冠中熒光信號尤為明顯，其表達(dá)位置與骨架蛋白β-Tubulin的位置一致，且通過DAPI細(xì)胞核標(biāo)記顯示，CYP11A1主要在卵丘細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

3 討論

促性腺激素在哺乳動物的早期卵泡生長發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。由垂體分泌的促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH），與卵泡膜上相應(yīng)受體結(jié)合，卵細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞增殖，調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的交換，抑制卵泡閉鎖，促進(jìn)有腔卵泡和排卵前卵泡的生長發(fā)育[15,16]。同時，F(xiàn)SH還具有促進(jìn)雌激素分泌的功能，所分泌雌激素中雌二醇的活性最高，對第二性征發(fā)育和卵巢排卵有積極的調(diào)控作用[17-19]。卵泡生長發(fā)育后期會分泌大量的促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH），有助于孕酮的分泌。孕酮又稱為黃體酮，起到調(diào)節(jié)黃體功能、保持受精卵在子宮中著床的位置、防止流產(chǎn)的作用[8]。另外，卵巢顆粒細(xì)胞分泌的孕酮會受到合成路徑關(guān)鍵酶的影響[20,21]。LH的刺激促進(jìn)類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，有助于促進(jìn)孕酮的合成分泌[22]。該蛋白將膽固醇轉(zhuǎn)運到CYP11A1所在的線粒體內(nèi)膜，由P450CYP11A1基因編碼的細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶對其側(cè)鏈進(jìn)行裂解，產(chǎn)生孕烯醇酮，孕烯醇酮在CYP11A1脫氫酶活性的作用下發(fā)生雙鍵位置異構(gòu)，生成孕酮[21][23]。由此可見，卵巢中的CYP11A1基因是影響類固醇激素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，與哺乳動物繁殖力有關(guān)[7][24]。惡劣的高原環(huán)境可能引起牦牛卵巢損傷和功能障礙，造成了其繁殖性能的特殊性[25]，而本研究表明CYP11A1會對牦牛的生長繁育產(chǎn)生積極影響，對提高牦牛生產(chǎn)性能具有重要的實踐意義。

本研究通過利用qRT-PCR技術(shù)對不同發(fā)育時期的卵泡及卵母細(xì)胞中CYP11A1基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CYP11A1基因在卵泡發(fā)育早期（3～5 mm）表達(dá)量最高，有研究表明雌激素在卵泡發(fā)育早期具有積極的刺激作用，而CYP11A1基因調(diào)控顆粒細(xì)胞分泌雌激素，該機制與本研究結(jié)果相互對應(yīng)。CYP11A1參與卵泡發(fā)育的整個時期，但主要集中在早期，為卵母細(xì)胞成熟提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，是整個發(fā)育過程的能量來源；在COCs放射冠形成前期，即M-MⅠ期CYP11A1表達(dá)量較高，而后顯著下降，推測CYP11A1可能參與放射冠的形成。根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果來看，CYP11A1在放射冠中的熒光更為明顯，推測CYP11A1誘導(dǎo)激素分泌，增強卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的物質(zhì)代謝，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，但由于CYP11A1蛋白在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均有所分布，不排除卵母細(xì)胞分泌蛋白作用于卵丘細(xì)胞的可能性，具體機制有待繼續(xù)進(jìn)行驗證。

4 結(jié)論

本試驗在牦牛不同級別卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的過程中對CYP11A1的表達(dá)進(jìn)行定位分析，研究發(fā)現(xiàn)，牦牛卵泡及卵母細(xì)胞不同時期發(fā)育時期均可檢測到CYP11A1的表達(dá)，在早中期表達(dá)量最高，而CYP11A1在COCs中的表達(dá)主要集中在放射冠，推測CYP11A1參與卵泡的發(fā)生和卵母細(xì)胞的形成，揭示了CYP11A1參與牦牛雌性生殖過程，對卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟均起到積極的調(diào)控作用。