徐文迪，田那科·沙帕爾，劉奎杰，韓同，趙華

（中南大學湘雅二醫(yī)院 胃腸外科，湖南 長沙 410011）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種全球性的常見病，是已知癌癥中第三大最常見類型，占全世界癌癥死亡主要原因的第二位[1]。據(jù)統(tǒng)計，在2018年，我國CRC新發(fā)病例數(shù)為521 590，占所有癌癥新發(fā)病例的12.2%。因罹患CRC而死亡的病例數(shù)為247 563，占所有癌癥病死率的8.6%[2]。而最新的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)表明，預計到2021年，僅美國就將有104 270例新增CRC癌癥病例及52 980例癌癥死亡病例[3]。

中國大多數(shù)CRC是結腸腺癌（colon-adenocarcinoma，COAD）是發(fā)生于腺上皮細胞的惡性腫瘤，是結腸癌最主要的病理類型之一。其他罕見類型包括鱗狀細胞癌、腺鱗癌、梭形細胞癌和未分化癌[4-5]。CRC是一種異質(zhì)性疾病，大約60%～65%的病例是偶發(fā)的，是通過獲得性體細胞遺傳和表觀遺傳變異引起的，這些變異主要歸因于可改變的潛在風險因素[6]。CRC患者的預后取決于癌癥的TNM分期和是否接受治愈性手術干預，但這僅限于原發(fā)早期的CRC患者。此外，CRC患者的臨床表現(xiàn)，治療效果和預后還受到例如表觀遺傳狀態(tài)和導致CRC異質(zhì)性的微環(huán)境等許多因素的影響[7]。

諸多研究表明，確定能夠早期進行診斷，準確監(jiān)測患者病情發(fā)展及其對治療的反應的生物標志物，對CRC患者進行早期診斷或切除是治愈大多數(shù)CRC患者的關鍵[8-9]。對于CRC的不良預后和高復發(fā)率，盡管最近的研究中發(fā)現(xiàn)的生物標志物對改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻[10-14]。但由于各種原因，諸如對小型發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的過度擬合和缺乏足夠的臨床驗證之類的問題，將便捷精確的篩選生物標志物的方法納入常規(guī)臨床實踐仍未實現(xiàn)。

近年來，由于飛速發(fā)展的微陣列技術和高通量測序技術，為尋找與癌癥相關診斷、治療和預后的關鍵的生物標志物提供了數(shù)據(jù)平臺[15]。但由于數(shù)據(jù)的多樣性及數(shù)據(jù)集之間潛在的生物學異質(zhì)性和跨測量平臺的技術偏見，以及研究基因表達水平所使用的傳統(tǒng)方法需要適當?shù)臍w一化，這些困難的任務為高效地利用生物信息帶來了艱巨的挑戰(zhàn)[16]。為了應對消除數(shù)據(jù)預處理（例如縮放和歸一化）局限性的問題，研究人員提出了一種基于基因表達水平相對排名的方法，已在包括癌癥分類在內(nèi)的各種應用中均可得到可靠結果[17-19]。

研究[20-21]表明，免疫逃逸、能量異常、基因突變、促瘤炎癥成為了新的腫瘤標志。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中所涉及的免疫系統(tǒng)的各種成分已被證明是癌癥的關鍵性因素[22-23]。

本研究探討一種由免疫相關基因（immunerelated gene，IRG）組成的免疫相關基因?qū)χ笖?shù)（immune-related gene pair index，IRGPI）為預后標志模型的構建，并且在癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集和基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)集中與CRC患者的臨床信息相關聯(lián)后對其進行了一系列的研究，從而證明免疫相關基因?qū)Γ↖RGP）與CRC患者預后的關聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過公開數(shù)據(jù)進行了回顧性研究。本研究選擇了2個獨立數(shù)據(jù)集，包括TCGA-COAD（臨床數(shù)據(jù)集452例，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集449例）以及GSE39582（585例）[24]，數(shù)據(jù)收集的時間為2020年4月25日—6月20日。其中TCGA-COAD數(shù)據(jù)集因其高質(zhì)量的臨床記錄及完善的長期隨訪而被用作訓練數(shù)據(jù)集，其臨床信息、基因表達矩陣從TCGA門戶（https://portal.gdc.cancer.gov）下載。為了驗證TCGA數(shù)據(jù)集中的研究結果，從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載了驗證數(shù)據(jù)集GSE39582中的基因表達矩陣和臨床數(shù)據(jù)作為外部驗證。

對于TCGA-COAD及GEO數(shù)據(jù)集，基于每組注釋文件將表達譜從探針水平轉(zhuǎn)換為相應的基因符號，而沒有進一步的標準化。對于同一個基因符號對應不同的表達值，將表達值其取均數(shù)。本研究通過對數(shù)據(jù)進行檢查，僅將具有完整臨床生存信息的患者用于后續(xù)分析。

1.2 CRC 特異性IRGP 的構建

進行TCGA數(shù)據(jù)集預后IRGP的構建[25]。于2020年3月28日從ImmPort數(shù)據(jù)庫（https://immport.niaid.nih.gov）下載了2 498個IRG用于構建IRGP。IRG包含17類，其中包括腫瘤壞死因子家族成員、轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員、趨化因子及細胞因子受體、細胞因子、白細胞介素、干擾素等。

對本研究所涉及的TCGA及GEO平臺上進行了變化相對較大（絕對偏差中值（median absolute deviation，MAD）＞0.5）的IRG的測量。對每個樣品中的IRG的表達值之間進行成對比較，以獲得每個IRGP的得分。如果在特定IRGP中第1個IRG的表達水平高于第2個IRG，則該IRGP的得分為1。否則，分數(shù)為0。去除變異相對較小的IRGP（80%以上的數(shù)據(jù)集樣本中IRGP的分數(shù)為0或1，這意味著樣本之間變化很微?。┖?，剩下的IRGP被保留下來作為初始候選IRGP用于進行后續(xù)分析。

這種基于基因成對比較的方法具有顯著優(yōu)勢，因為該方法是完全基于腫瘤樣本的基因表達譜來計算的得分，可以不需要標準化而以個性化的方式使用[22]。

1.3 IRGPI 的構建

為得到最穩(wěn)定的基因?qū)δＰ蛠順嫿A后標志，將TCGA-COAD數(shù)據(jù)集以及GEO數(shù)據(jù)集中的臨床數(shù)據(jù)整理，得到CRC患者樣本中的生存時間及生存狀態(tài)，將其與初始IRGP相合并，運用Cox回歸及Kaplan-Meier法選擇與CRC預后顯著相關的IRGP（P＜0.001）。為了避免數(shù)據(jù)過度擬合的風險，選擇預后顯著相關的IRGP，使用R軟件包“glmnet”（版本：3.0-2）應用Lasso-Cox回歸（迭代1 000次），并最終選擇了20個IRGP定義為最終IRGPI。

使用R 語言包“survivalROC”（版本：1.0.3）、“survival”（版本：3.1-11）構建時間依賴性受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，用以確定IRGPI的最佳截止（cut-off）值，從而將CRC患者分為低風險組和高風險組。

1.4 IRGPI 的驗證

為了評估IRGPI標志的價值，首先通過Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗對CRC患者繪制了生存曲線。隨后選擇了高-低風險組的相關臨床因素，通過單變量和多變量Cox比例風險分析來評估IRGPI。在單變量分析中，針對每個數(shù)據(jù)集中的臨床因素、病理因素及IRGPI進行了風險評分。隨后，在多變量Cox分析中將IRGPI與可用的臨床和病理變量相結合，年齡、性別及T、N分期被視為連續(xù)變量，從而進一步對IRGPI進行評估。

1.5 浸潤免疫細胞的分析

采用一種可預測新鮮，冷凍及固定組織（包括實體瘤）免疫細胞浸潤的流行算法，CIBERSORT[26]，以便用于了解不同風險人群的免疫細胞浸潤。CIBERSORT是一種從復雜組織的基因表達譜中表征其細胞組成的方法，對于緊密相關的細胞類型方面優(yōu)于其他方法。CIBERSORT對腫瘤樣品進行去卷積算法，對于每種細胞類型都使用了支持向量回歸[27]。對于每個樣品，CIBERSORT能夠推斷出22種浸潤免疫細胞的相對比例。使用R軟件包“CIBERSORT R script”（版本：1.03）對每一個樣本進行了浸潤免疫細胞的相對比例的計算。

1.6 功能注釋和分析

為了在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上了解構成IRGPI的IRG的真實表達，使用了人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA，https://www.proteinatlas.org/）。HPA是一個可公開獲得的數(shù)據(jù)庫，包含近20種常見癌癥的基于免疫組織化學的表達數(shù)據(jù)，并且可提供一張基于組織和器官及微陣列的免疫組化的人類組織蛋白質(zhì)組圖譜。從而顯示了不同正常組織和癌癥組織中蛋白質(zhì)的空間分布[28-29]。

為了能夠了解IRGPI的相關生物學功能，本研究通過R 語言包“cluster Profiler”（版本：3.14.3）對構成IRGPI的IRG進行了基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。為了明確高風險和低風險組之間顯著改變的G O 途徑，在兩基因組間使用Bioconductor軟件包“FGSEA”（版本，1.12.0）進行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[30]。本研究中涉及的生物學過程是使用了MSigDB（Molecular Signatures Database）標記基因集，選擇P＜0.05的數(shù)據(jù)作為有統(tǒng)計學意義的基因集。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計檢驗均使用R 語言軟件（版本3.6.1，https//www.r-proje ct.org/）及SPSS軟件（SPSS version 22）進行。對于所有測試，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IRGPI 的構建及定義

整個工作流程如圖1所示。本研究共納入有完整臨床數(shù)據(jù)的1 018個樣本（表1）。TCGA-COAD隊列作為訓練數(shù)據(jù)集，GSE39582隊列作為驗證數(shù)據(jù)集。從ImmPort數(shù)據(jù)庫獲得的2 498個IRG來構建IRGP。在所有數(shù)據(jù)集中均進行了測量，并滿足訓練集上的相關標準（中位絕對偏差MAD＞0.5）后，共挑選出有473個IRG，并且構建了個111 392個IRGP。在訓練數(shù)據(jù)集中刪除相對變異較小的IRGP之后，得到12 275個IRGPs。隨即合并樣本臨床信息，選擇有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）的28個IRGP作為初始候選IRGP。對于初始候選IRGP使用了Lasso Cox比例風險回歸并且經(jīng)過了1 000次的隨機循環(huán)，最終選擇了20個IRGP構成IRGPI。IRGPI由28個唯一的IRG組成（表2）。

圖1 構建及驗證與CRC 患者IRGP 標志的工作流程Figure 1 The workflow of constructing and verifying the IRGP signature in CRC patients

表1 TCGA-COAD 和GSE39582 數(shù)據(jù)集患者的臨床特征Table 1 Patient demographics and clinical characteristics in TCGA-COAD and GSE39582 datasets

表2 IRGPI 的相關信息Table 2 Information on the IRGPI

2.2 IRGPI 的驗證和評估

時間相關的ROC曲線IRGPI最佳截止值為-1.239（圖2）。根據(jù)CRC患者總生存率（overall survival，OS），使用IRGPI的最佳截止值將訓練數(shù)據(jù)集中的患者分為低風險和高風險組（表1）。根據(jù)分析可知高風險組的OS明顯低于低風險組（P=1.295×10-11，HR=6.51，95%CI=3.79～11.21）（圖3A）。

對訓練數(shù)據(jù)集進行單變量和多變量Cox回歸分析，以便于進一步了解IRGPI是否可以作為CRC患者的獨立預后因素。在單變量Cox分析中，患者的年齡及腫瘤的T、N分期以及IRGPI對預后的影響具有統(tǒng)計學意義。在多變量分析中，IRGPI標記仍舊是一個獨立的預后相關因素（圖4A-B）。為了明確在不同人群中IRGPI是否具有與訓練數(shù)據(jù)集類似的預后價值，將相同的公式應用于驗證數(shù)據(jù)集（GSE39582）作為外部驗證。按照與訓練數(shù)據(jù)集同樣的分組標準，將驗證數(shù)據(jù)集的患者分為高風險和低風險組，然后進行相關生存分析后可得到與訓練數(shù)據(jù)集類似的結果。高風險組的OS明顯低于低風險組（P=0.000 1，HR=1.82，95%CI=1.36～2.44）（圖3B）。在驗證數(shù)據(jù)集中，仍舊采用單變量和多變量Cox回歸分析。最終分析結果表示：無論在單變量以及多變量Cox回歸分析當中，IRGPI均有統(tǒng)計學意義。因此，IRGPI標記為影響CRC患者生存預后的獨立因素（圖4C-D）。

2.3 高、低風險組中的免疫細胞浸潤

前期研究[23,31]顯示，CRC細胞凋亡與其微環(huán)境中免疫細胞凋亡和浸潤程度密切相關。CIBERSORT已經(jīng)用于癌癥微環(huán)境的相關研究中，其可以對實體腫瘤樣品進行去卷積從而估計免疫細胞亞群[32-33]。本研究使用CIBERSORT來評估不同風險組中每位患者的22種不同免疫細胞的相對比例。圖5A描繪了高-低風險組使用CIBERSORT輸出的免疫細胞豐度的匯總，不同的風險組所浸潤的免疫細胞表達量有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）（P=0.007）巨噬細胞（M0）（P=0.024）在高風險組中顯著高表達，而在低風險組中靜息樹突狀細胞（dendritic cells resting，P=0.006），靜息CD4+記憶T細胞（P=1.784e-05）的百分比明顯升高（圖5B）。

圖2 訓練數(shù)據(jù)集中IRGPI 的ROC 曲線 Figure 2 ROC curve of IRGPI in training dataset

圖3 高、低風險組之間的CRC 患者的OS 曲線 A：訓練數(shù)據(jù)集；B：驗證數(shù)據(jù)集Figure 3 OS curves of CRC patients in high-risk group and low-risk group A: Training dataset; B: Validating dataset

圖4 CRC 患者預后的單因素和多因素Cox 回歸分析的森林圖 A：基于單因素分析評價IRGPI 對TCGA-COAD 中CRC 患者預后的價值；B：基于多因素分析評價IRGPI 對TCGA-COAD 中CRC 患者預后的價值；C：基于單因素分析IRGPI 對GSE39582 中CRC 患者預后的價值；D：基于多因素分析IRGPI 對GSE39582 中CRC 患者預后的價值Figure 4 Forest plot of univariate and multivariate Cox regression analysis for the prognosis of CRC patients A: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on univariate analysis; B: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on multivariate analysis; C: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in GSE39582 based on univariate analysis; D: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TGSE39582 based on multivariate analysis

圖5 CRC 患者高、低風險組中的免疫細胞浸潤分析 A：CIBERSORT 評估了高、低風險組中22 種免疫細胞豐度；B：特定免疫細胞在高、低風險組中的豐度分布Figure 5 Analysis of immunocyte infiltration in high and low risk groups of CRC patients A: CIBERSORT evaluation of the abundance of 22 immune cells in high and low risk groups; B: Abundance distribution of specific immune cells in high and low risk groups

2.4 IRGPI 的功能注釋

為了驗證此模型中的IRG在組織蛋白中的表達，使用HPA 數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學法分析了正常人組織和CRC組織中的蛋白質(zhì)表達模式。結果表明，與正常組織比較，CRC 組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A的表達上調(diào)（圖6）。為了解IRGPI標志所涉及的相關生物學過程，對構成IRGPI的28個IRG進行了KEGG及GO富集分析。從KEGG的分析結果顯示，28個IRG所涉及的主要通路有：細胞因子-細胞因子-受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路等（圖7A-B）（表2）。而GO分析表明，IRGPI中的相關IRG涉及的分子功能（MF）有：受體配體活性、細胞因子活性、趨化因子活性、細胞因子受體結合等功能。所涉及的生物過程（BP）有：白細胞遷移、細胞趨化性、白細胞-細胞黏附的調(diào)節(jié)等過程。而涉及的細胞組成（CC）大致包括：膜區(qū)、分泌顆粒膜、免疫突觸等成分（圖7 C）。對訓練數(shù)據(jù)集的高、低風險組之間進行了GSEA分析，以研究顯著改變的GO過程?；贕SEA 的分析表明，訓練數(shù)據(jù)集中高-低風險組之間顯著改變的生物學過程主要有：角化細胞分化、角化、表皮細胞分化、皮膚發(fā)育等過程 （圖7 D-E）。與腫瘤相關的功能注釋提供了IRGPI標記影響分子機制的證據(jù)，從而可用于準確預測CRC患者的預后。

圖6 CRC 組織中的蛋白質(zhì)免疫組織化學法的表達（×100）Figure 6 Expression of protein in CRC tissue by immunohistochemical method (×100)

圖7 IRGPI 的功能富集分析 A-B：28 個免疫特征基因的KEGG 富集分析結果；C：28 個免疫特征基因的GO 富集分析結果； D：高、低風險組之間顯著改變途徑（角化，角質(zhì)形成細胞分化，表皮細胞分化，皮膚發(fā)育）的GSEA 分析結果； E：28 個免疫特征基因的基因集富集分析（GSEA）結果Figure 7 Functional enrichment Analysis of IRGPI A–B: Results of KEGG enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; C: Results of GO enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; D: GSEA analysis for significantly changed pathways between high and low risk groups (keratinization, epidermal cell differentiation, and skin development); E: Enrichment analysis (GSEA) 28 immune characteristic genes

3 討 論

隨著高速發(fā)展的微陣列技術和高通量測序技術，生物信息學技術成為了可以用于篩選生物標志物的強有力工具。并且在多種類癌癥中得到了相關的應用及驗證[34-36]。針對于高發(fā)病率的CRC，我國目前的采取以手術治療為主，多學科綜合治療的原則。而就包括了目前正處于高速發(fā)展階段的免疫治療[37]。在之前有關免疫治療的研究中所提及的：在轉(zhuǎn)移性CRC患者錯配修復缺陷治療中取得明顯療效的抗程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）藥物，使得CRC的免疫治療得到了進一步的重視[38]。為了達到增加患者生存，延緩腫瘤進展的目的，免疫治療可通過增強機體免疫反應，激發(fā)腫瘤特異性免疫，打破免疫耐受，重新激活免疫細胞等途徑從而識別并殺傷腫瘤細胞[39]。目前，比較熱門的免疫治療方式有腫瘤疫苗、免疫檢查點抑制劑以及小分子治療等，免疫治療在一定程度上改善了CRC 患者的預后，是一種有前景的治療選擇[40]。

對于CRC的不良預后和高復發(fā)率，盡管最近的國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)的生物標志物對改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻[41-43]，但是從生物的復雜性，個體差異，以及免疫因素的考慮，迫切需要找到強有力的預后生物標志物來預測CRC患者的生存情況，從而對CRC患者采取相應的治療措施。本研究成功構建了一種由28個IRG組成的20個IRGP作為預后標志，并且在TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中均得到了其準確性的驗證，從而充分證明了IRGPI是與CRC患者預后相關的重要因素。

本研究詳細分析了這些構成IRGPI的IRG，參與構建20對IRGP的大多數(shù)基因是細胞因子、抗菌劑家族成員，它們對于免疫微環(huán)境的構成中扮演者重要角色。通過HPA數(shù)據(jù)庫的分析可知，CRC組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A基因在蛋白表達水平上較正常組織上調(diào)，表明這些基因在CRC組織中更為活躍。而在以前的研究中，提出APOD作為多種癌癥類型（包括CRC）的預后標志物[44]；血清中AGR2參與了卵巢交界性腫瘤病情的發(fā)生、發(fā)展[45]； BTS-2的表達增強腎細胞癌的細胞生長和侵襲性[46]；胃癌組織中BST2 mRNA高表達，與腫瘤惡性程度有關，有望成為診斷胃癌新的生物標志物。BST-2 參與了人巨細胞病毒感染導致的惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移[47]；骨髓來源的間充質(zhì)干細胞通過CCR5促進CRC的進展[48]；INHBB在CRC中過表達，并與浸潤深度，淋巴結轉(zhuǎn)移，遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關，與CRC的不良OS和DFS正相關[49]；肝硬化患者血清中炎性趨化因子如CCL4和CCL5的高水平表明存在肝細胞癌[50]；CCR7在結腸癌組織中高表達，其表達水平與結腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關[51]；PTGS2表達與大腸癌患者的腫瘤復發(fā)風險增加和大腸癌特異性生存率降低有關[52]；CCL28作為趨化因子，大量研究表明其在不同腫瘤中的表達異于正常組織，研究CCL28在腫瘤生成中的調(diào)控的具體作用機制有助于明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，為腫瘤的診療提供理論依據(jù)[53]；CRBP-1過表達與舌鱗狀細胞癌預后不良有關[54]；RBP7的異位表達增加了結腸癌細胞的遷移和侵襲[55]；STC2是CRC患者OS的獨立預后因素，STC2高表達與淋巴結轉(zhuǎn)移，遠處轉(zhuǎn)移，晚期臨床階段和較差的臨床結局密切相關[56]；根據(jù)前人的研究可知上述的基因參與了腫瘤發(fā)展和預后的過程，從而有助于合理的認為本研究中構建的IRGPI中的其他IRG也與CRC患者的預后相關，但仍需要進一步的實驗進行相關的驗證。

對于對IRG的功能注釋的結果可知IRGPI中一些基因在白細胞遷移、細胞趨化性、細胞因子-細胞因子-受體相互作用等過程中起關鍵作用。據(jù)相關研究表明，這些標志所涉及的生物功能和途徑與腫瘤的進展和預后相關[57-61]。通過GSEA指出高風險組中主要腹肌的過程有：角化細胞分化、角化、表皮細胞分化、皮膚發(fā)育等，以上途徑在之前的研究中亦可證明與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[62-64]。

根據(jù)對高-低風險組的免疫分析，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞，巨噬細胞M0在高危組中顯著高表達。在過去的研究中，可知調(diào)節(jié)性T細胞，巨噬細胞M0增多，對腫瘤免疫產(chǎn)生負面影響，并與不良預后相關[65-68]。而對于低風險組高表達的靜息樹突狀細胞，腫瘤浸潤性樹突狀細胞在直腸癌組織中低表達，不成熟細胞比例增加，與TNM分期和腫瘤直徑有關[22]。靜息CD4+記憶T細胞與腫瘤更好的預后相關[69]。以上這些研究結果表明，IRGPI標記可作為CRC患者可靠的預后生物標記物。

本研究采用了一種新的方法用于不同平臺數(shù)據(jù)的處理，相較于傳統(tǒng)的生物標志的研究是基于全基因組水平進行的，本研究中所構建的生物標志是基于免疫相關基因而進行的，并且采取了專門設計的分析流程及方法。傳統(tǒng)的生物信息學方法一般是根據(jù)正常或癌旁組織與腫瘤組織的基因表達差異來進行后續(xù)的研究，需要將數(shù)據(jù)進行歸一化及克服跨平臺的偏見，而本研究基于同一樣本基因表達譜內(nèi)每一個基因表達值的相對排名而進行的成對比較后得到的一組分值來構建IRGP。不僅可以避免不同數(shù)據(jù)庫及平臺產(chǎn)生的技術偏見以及因生物學異質(zhì)性而帶來的不同腫瘤個體間的偏差[70-71]，而且也可以克服傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析需要預處理數(shù)據(jù)的難點。從而得到與其他研究相比重復率較低且穩(wěn)健的生物標志。本研究所使用的新方法在包括癌癥在內(nèi)的許多研究中均具有可靠的結果[17-19,25,72]。因此本研究所構建的生物標志可以實現(xiàn)單樣本、精準化、高效率地評估CRC患者的預后，這是本研究所具有的優(yōu)勢之一。

在本研究中，IRGPI標志物的構建是使用與傳統(tǒng)研究不同的Lasso回歸經(jīng)過了1 000次的迭代構建的，它可以避免過度擬合從而確定最佳的變量。利用CRC患者ROC曲線分析確定的最佳截止值，將訓練數(shù)據(jù)集中的患者分為高風險組和低風險組。經(jīng)過相關分析，兩組預后有顯著統(tǒng)計學差異。Lasso回歸以及ROC曲線的最佳截止值的相關應用還可適用于其他不同的數(shù)據(jù)集和臨床隊列，這也是本研究所具有的重要優(yōu)勢。

本研究依舊具有局限性。首先，本研究采取的是回顧性分析，本研究所涉及的訓練數(shù)據(jù)集及驗證數(shù)據(jù)集均使用公開數(shù)據(jù)庫中的樣本。雖然兩個大型公開數(shù)據(jù)庫擁有公認的穩(wěn)定性及可靠性，但是對于數(shù)據(jù)庫中石蠟切片樣品的穩(wěn)定性和有效性仍有待進一步考證。如需進一步驗證研究結果，則需要進行前瞻性隊列研究。其次，本研究中所涉及的基因表達特征會受到由腫瘤內(nèi)生物學異質(zhì)性及統(tǒng)計學偏差所帶來的影響。盡管使用了樣本量較大的TCGA及GEO兩個數(shù)據(jù)集，但仍舊需要包含具有不同樣本屬性的更多數(shù)據(jù)集，以進行更廣泛的驗證。最后，本研究所使用的基因表達矩陣是基于RNA-seq或微陣列平臺產(chǎn)生的，由于其價格高，轉(zhuǎn)化周期長以及對生物信息學專業(yè)知識有較高要求而使其在日常臨床應用中受到了一定的限制[73]。

綜上所述，本研究成功構建了由20個IRGPI標志。并且了解它們作為一種生物標志所擁有的預后價值。本研究中所構建的IRGPI標志是CRC患者的生存的獨立預后因素。通過進一步生物學功能分析，可以了解這些IRGPI在CRC的發(fā)生發(fā)展中的功能，從而為CRC的治療方式提供了一種新的思路。該標記或?qū)⒊蔀橐环N評價CRC患者是否能夠獲益于相關免疫治療的新型精準化預測工具。