楊文麗，孫曉杰，呂金枝，苗艷明

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

蛋白質(zhì)已成為后基因組時代生命科學和生物醫(yī)學等相關領域研究的焦點。然而，長期以來抗原-抗體識別的方法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)分析方法，而量子點(Quantum Dots,QDs)，表面分子印跡聚合物(Surface Molecularly Imprinted Polymers,SMIPs)納米復合材料(QDs-人工抗體)為經(jīng)典蛋白分析方法開啟了新的解決方案。QDs的粒徑大小與蛋白等生物大分子相匹配，而QDs又具備優(yōu)異發(fā)光特性，因此QDs是蛋白分子的傳感的較理想材料[1,2]。但QDs對蛋白質(zhì)的識別無特異性。而SMIPs是模仿自然界抗原-抗體反應原理[3,4]，對目標分子具有較高的專一識別性能[5]，且具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、成本低等特點[6 - 8]。

目前，有關QDs的SMIPs主要是基于QDs的熒光性質(zhì)[8 - 11]，但生物樣品所具有的背景熒光干擾使其在實際應用中受到局限，由于生物樣品中磷光極為少見，因此QDs的室溫磷光(RTP)性質(zhì)可以有效地避免上述情況的發(fā)生[12,13]。本研究發(fā)展了一種既具有人工抗體功能又具有室溫磷光特性的Cyt c QDs-SMIPs納米復合材料，并實現(xiàn)對Cyt c的選擇性識別分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

磷光由Cary Eclipse熒光分光光度計(美國，瓦里安有限公司)測定；pH值由pH酸度計(上海安萊立思儀器(中國)科技有限公司)測量；Mn-ZnS QDs的形貌采用JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子)測量；QDs-SMIPs形貌由SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，日立公司)測量；紫外-可見光譜通過島津UV-29100分光光度計進行測定。

3-巰基丙酸(MPA)、牛血清蛋白(BSA)和卵白蛋白(OB)購于北京百靈威科技有限公司；Na2S·9H2O購于上海源葉生物有限公司；Zn(Ac)2·2H2O和Mn(Ac)2·4H2O購于天津市科密歐化學試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和細胞色素c(Cyt c)購于Sigma(美國)；NaOH購于天津市風船化學試劑科技有限公司。所用的試劑均為分析純，超純水(18.2 MΩ·cm)采用WaterPro超純水系統(tǒng)(美國Labconco公司)制備。

1.2 Mn-ZnS QDs的合成

Mn-ZnS QDs在已有文獻方法[14]的基礎上合成。簡要過程為：取100 mL 0.04 mol·L-1MPA溶液，10 mL 0.1 mol·L-1的Zn(Ac)2溶液，4 mL 0.01 mol·L-1的Mn(Ac)2溶液，加入到250 mL的三頸燒瓶中。然后用1 mol·L-1NaOH溶液將上述溶液的pH值調(diào)節(jié)至11，隔絕空氣反應30 min后，再用注射器將10 mL 0.1 mol·L-1的Na2S溶液加入到上述溶液中，密閉攪拌反應20 min。將得到的上述溶液50 ℃陳化2 h。加入同等體積的無水乙醇使QDs沉降，高速離心得到沉淀，真空干燥24 h，即可得到所需的Mn-ZnS QDs粉末。

1.3 Cyt c QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的合成

將5 mg的模板分子Cyt c，10 mL 1 mg·mL-1的Mn-ZnS QDs溶液，20 μL APTES依次加入到兩口燒瓶中，攪拌30 min，再加入0.10 mL TEOS溶液和0.10 mL氨水，反應12 h。將得到的QDs-SMIPs離心，并用0.5%SDS溶液洗滌。非印跡聚合物(QDs-SNIPs)的制備過程除沒加模板分子外其余步驟同上。

1.4 磷光檢測

首先制備濃度為250 μmol·L-1的Cyt c溶液，然后在比色管中依次加入500 μL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)，50 μL 1 mg·mL-1QDs-SMIPs或QDs-SNIPs溶液，以及不同體積的Cyt c溶液，定容至5 mL，搖勻，反應5 min，用305 nm為激發(fā)波長測定其磷光。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷光QDs及QDs-SMIPs的表征

由Mn-ZnS QDs的透射電鏡圖(圖1(a))可知Mn-ZnS QDs粒徑約為3.5 nm左右。該QDs的最大磷光激發(fā)峰為305 nm(圖1(b)曲線1)，最大磷光發(fā)射峰為590 nm(圖1(b),曲線2)，該室溫磷光性質(zhì)由Mn2+的4T1-6A1的躍遷產(chǎn)生[15]，ZnS母體吸收激發(fā)光后，其電子受到激發(fā)，空穴則被Mn2+俘獲，電子和空穴各自在Mn2+上復合導致Mn2+的激發(fā)，完成三重態(tài)(4T1)到基態(tài)(6A1)的躍遷并產(chǎn)生橙色磷光[11,16]。

圖1 (a)Mn-ZnS QDs透射電鏡(TEM)圖；(b) Mn-ZnS QDs的激發(fā)光譜(曲線1)和發(fā)射光譜(曲線2)圖Fig.1 (a) TEM image of Mn-ZnS QDs;(b) Excitation(curve 1) and emission(curve 2) spectra of Mn-ZnS QDs

圖2(a)為QDs-SMIPs的掃描電鏡圖，由圖中可知QDs-SMIPs的粒徑明顯大于圖1(a)Mn-ZnS QDs的粒徑，表明SMIPs已經(jīng)成功包覆在Mn-ZnS QDs的表面。圖2(b)為QDs-SMIPs、QDs-SNIPs和QDs的紅外光譜。1 141 cm-1處的強峰為Si-O-Si的伸縮峰，785 cm-1為Si-O的振動峰，3 142 cm-1處的峰為C-H的伸縮峰，3 440 cm-1和1 628 cm-1為N-H的伸縮振動峰，這表明QDs的表面已經(jīng)包覆了印跡材料。由于QDs-SMIPs和QDs-SNIPs成分相似，所以兩者的主要吸收峰的位置也相似。

圖2 (a) QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的掃描電鏡(SEM)圖;(b)QDs-SMIPs、QDs-SNIPs人工抗體納米復合材料和Mn-ZnS QDs傅立葉紅外(IR)光譜圖Fig.2 (a) SEM image of QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites;(b) IR spectra of QDs-SMIPs，QDs-SNIPs artificial antibody nanocomposites and Mn-ZnS QDs

2.2 影響QDs-SMIPs穩(wěn)定的因素

由圖3(a)可知，QDs-SMIPs的磷光強度隨著pH值的增大呈上升趨勢，pH值7.5時QDs-SMIPs的磷光強度達到最大值。且在pH為7.0～8.0范圍內(nèi)相對穩(wěn)定。由于生理pH值為7.4，因此將7.4作為該傳感體系的最佳pH值。QDs-SMIPs的磷光強度在80 min內(nèi)(圖3(b))，及0.7 mol·L-1較高鹽濃度下(圖3(c))基本保持相對穩(wěn)定。

圖3 pH值(a)、時間(b)和鹽濃度(c)對QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料的影響Fig.3 Effects of pH (a),time (b) and salt concentration (c) on QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites

2.3 QDs-SMIPs的識別性能

2.3.1 QDs-SMIPs對目標蛋白的識別分析由圖4(a)可知，隨著Cyt c濃度的逐漸增加，QDs-SMIPs的磷光強度逐漸降低，且磷光猝滅強度與Cyt c濃度之間呈良好的線性關系，線性范圍為0.25～5.0 μmol·L-1，檢出限為0.015 μmol·L-1，相關系數(shù)R=0.999，相對標準偏差為3.66%。比較圖4(a)和圖4(b)，QDs-SMIPs對Cyt c的識別效果明顯優(yōu)于QDs-SNIPs人工抗體納米復合材料，表明QDs-SMIPs對Cyt c具有更強的結(jié)合能力。

圖4 不同濃度Cyt c與QDs-SMIPs(a)和QDs-SNIPs(b)人工抗體納米復合材料磷光的關系Fig.4 Relationship between Cyt c concentrations and phosphorescence of QDs-SMIPs(a) and QDs-SNIPs (b) artificial antibody nanocompositesAll solutions were prepared in PBS(20 mmol·L-1,pH=7.4).

與其他納米材料檢測Cyt c方法的比較[16 - 21]見表1。本研究中的QDs-SMIPs檢測Cyt c的檢出限低于或相當于其他方法。更重要的是該方法是基于QDs的磷光性質(zhì)，能夠避免生物樣品背景熒光的干擾，提高了檢測效率和檢測特異性，且減少了生物樣品復雜的前處理過程。

2.3.2 QDs-SMIPs的競爭實驗為驗證QDs-SMIPs對目標蛋白Cyt c的特異性識別能力，本研究進行了競爭實驗。由圖5(a)和圖5(b)可看出，隨著cOB/cCytc和cBSA/cCytc比值的增加，QDs-SMIPs的磷光強度變化較小，原因在于Cyt c與QDs-SMIPs表面的印跡位點相匹配，QDs-SMIPs可以特異地結(jié)合Cyt c，進而引起QDs-SMIPs明顯的室溫磷光強度變化。而競爭蛋白因為與印跡位點不匹配，結(jié)合能力較弱，因此不會明顯影響QDs-SMIPs對Cyt c識別。競爭實驗進一步證明該QDs-SMIPs對Cyt c具有較強的特異識別能力。

表1 測定Cyt c含量方法的比較

圖5 爭蛋白OB(a)和BSA(b)對QDs-SMIPs人工抗體納米復合材料識別Cyt c(5 μmol·L-1)的影響Fig.5 Effects of competitive proteins OB(a) and BSA(b) on QDs-SMIPs artificial antibody nanocomposites in Cyt c(5 μmol·L-1) identificationPBS(20 mmol·L-1,pH 7.4).

2.3.3 QDs-SMIPs的吸附-解吸性能圖6(a)為5 μmol·L-1的Cyt c蛋白質(zhì)溶液經(jīng)QDs-SMIPs和QDs-SNIPs吸附前后的紫外-可見光譜。吸附前(曲線1)與QDs-SNIPs吸附后Cyt c的紫外可見吸收值(曲線2)相比變化較小，但經(jīng)QDs-SMIPs吸附后上清液中Cyt c的濃度明顯降低(曲線3)，依據(jù)紫外吸收光譜計算QDs-SNIPs的平均吸附容量為3.92 μmol·L-1，QDs-SMIPs的平均吸附容量為0.86 μmol·L-1(圖6(b))，說明印跡材料對模板分子具有良好的富集能力，而QDs-SNIPs由于沒有印跡位點，主要是非特異性吸附。

本研究還對QDs-SMIPs的解吸特性進行了分析。用0.5%SDS溶液洗滌吸附Cyt c后的QDs-SMIPs，并測定水相中Cyt c的最終濃度，然后通過洗脫液中Cyt c與QDs-SMIPs吸附Cyt c的量的比值計算解吸率，吸附-解吸循環(huán)5次。由圖6(c)可知，隨著吸附-解吸次數(shù)的增加，吸附率變化在92%～95%之間(圖6(c)插圖)，吸附量和解吸量呈逐漸減少趨勢。這可能與洗滌過程中QDs-SMIPs的損失有關，但總體變化都較小。以上結(jié)果表明在反復使用5次的情況下QDs-SMIPs的解吸能力基本保持穩(wěn)定。

Fig.6 (a) 5 μmol·L-1的Cyt c蛋白質(zhì)溶液紫外-可見光譜(曲線1)，QDs-SNIPs吸附后的紫外-可見光譜(曲線2)，QDs-SMIPs吸附后的紫外-可見光譜(曲線3)；(b)QDs-SMIPs和QDs-SNIPs吸附Cyt c的量；(c)在吸附-解吸循環(huán)5次條件下，QDs-SMIPs吸附量和解吸量以及解吸率(插圖)的變化情況Fig.6 (a) The UV-Vis spectrum of 5 μmol·L-1 Cyt c protein solution(curve 1),the UV-Vis spectrum after QDs-SNIPs adsorption(curve 2),the UV-Vis spectrum after QDs-SMIPs adsorption(curve 3)；(b) The amount of Cyt c adsorbed by QDs-SMIPs and QDs-SNIPs;(c) Under the condition of 5 cycles of adsorption-desorption,the changes of adsorption,desorption capacity and desorption rate(Illustrated) of QDs-SMIPs

2.3.4 QDs-SMIPs的干擾實驗為考察生物體樣品中的一些常見金屬離子和生物分子對QDs-SMIPs檢測體系的影響，進行了干擾實驗。將干擾物加入到QDs-SMIPs和Cyt c的混合溶液中，測量室溫磷光強度，結(jié)果表明，100 000倍Na+，10 000倍的K+、Mg2+、葡萄糖，500倍的Ca2+，0.05倍的Al3+，0.04倍的Cu2+，0.02倍的Fe3+、谷氨酸，200倍的丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸，100倍的賴氨酸，50倍的精氨酸對室溫磷光強度基本無影響，部分金屬離子(Al3+、Cu2+、Fe3+)對該檢測體系影響較大，但生物樣品中這些金屬離子含量很低，影響較小，并可通過稀釋樣品的方法進一步降低其影響。以上結(jié)果表明QDs-SMIPs檢測體系對Cyt c具有較好的選擇識別能力。

2.4 Cyt c猝滅QDs-SMIPs磷光的機理

Cyt c屬具有鐵卟啉中心的含鐵蛋白質(zhì)，其中所含的Fe(Ⅲ)是一種高效的猝滅劑，具有電子傳遞功能[22]。QDs受到光激發(fā)時，Cyt c(Ⅲ)可以直接截獲受激電子轉(zhuǎn)變?yōu)镃yt c(Ⅱ)，導致QDs磷光猝滅[23,24]。過程如下：

(1)

(2)

為驗證Cyt c中的Fe(Ⅲ)是QDs磷光猝滅的原因，本研究將不同濃度的Fe2(SO4)3溶液分別加入到QDs溶液中，靜置5 min后測定QDs的磷光，表明在一定范圍內(nèi)Fe(Ⅲ)與室溫磷光猝滅量ΔRTP呈良好的線性關系，由此推測QDs-SMIPs磷光猝滅的主要原因是Fe(Ⅲ)。為進一步驗證QDs的磷光猝滅是由Fe(Ⅱ) 引起，本研究將Cyt c與QDs-SMIPs反應體系進行80 ℃加熱處理，加熱處理后的Cyt c對QDs-SMIPs的猝滅強度明顯降低。這是由于經(jīng)過加熱處理的Cyt c在反應過程中生成的Fe(Ⅱ)有一部分會變回Fe(Ⅲ)[25]，而未加熱處理的Cyt c在反應過程中生成的Fe(Ⅱ)不變，這進一步證明QDs-SMIPs磷光的猝滅由Cyt c中的Fe(Ⅲ)引起。

綜上得出，Cyt c(Ⅲ)結(jié)合于QDs-SMIPs表面后可截獲受激電子并轉(zhuǎn)變?yōu)镃yt c(Ⅱ)，進而阻止了受激電子和QDs內(nèi)空穴的復合，導致QDs-SMIPs磷光猝滅，因此，Cyt c對QDs-SMIPs的磷光猝滅過程為光誘導的電子轉(zhuǎn)移。

2.5 樣品分析

為驗證QDs-SMIPs能否用于實際生物樣品中Cyt c含量的測定，進行了人血清和尿液樣品的加標回收實驗(尿液和血清樣品均來自健康志愿者)，樣品加標回收率在96%～104%之間，結(jié)果如3所示。

表3 血清和尿液中Cyt c的加標回收試驗

3 結(jié)論

本研究以SMIPs為人工抗體，Mn-ZnS磷光QDs為信號載體，制備了一種可對Cyt c識別分析的磷光型QDs-SMIPs人工抗體。在最佳實驗條件下，該QDs-SMIPs不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對Cyt c的選擇性識別分析，而且其具有的磷光特性能夠避免生物樣品背景熒光的干擾，因此該方法更適用于生物樣品中痕量Cyt c的檢測，并為其他種類蛋白質(zhì)分子的分析檢測提供方法借鑒。