王成 曹孝榮 黃哲璟 王揚(yáng)劍

肌腱損傷包括各種急性損傷和慢性退行性改變[1-2]，損傷后的自然愈合是一個(gè)緩慢的過程，組織常發(fā)生纖維化，導(dǎo)致肢體功能受限，因此常需要手術(shù)干預(yù)和康復(fù)治療[3-4]。然而，術(shù)后肌腱由于膠原纖維的無序沉積以及瘢痕組織的形成，可導(dǎo)致肌腱生物力學(xué)性能喪失[3-4]。另外，肌腱漫長的重塑過程可致肌腱粘連或關(guān)節(jié)攣縮[5-6]，發(fā)生再損傷的概率也很高。因此，迫切需要提高受損肌腱的愈合效率及質(zhì)量[3，5-6]，基于細(xì)胞的肌腱組織工程有望解決這一問題。肌腱來源的肌腱干細(xì)胞（tendon derived stem cells，TDSC）具有多向分化的能力，在維持肌腱穩(wěn)態(tài)和損傷后修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是肌腱愈合較好的細(xì)胞來源之一[7-9]。在應(yīng)用外源性TDSC促進(jìn)肌腱愈合的研究中發(fā)現(xiàn)，TDSC注入體內(nèi)后需要經(jīng)歷存活、活化、增殖和分化等過程，合適的生長因子可促進(jìn)TDSC增殖和向成纖維細(xì)胞分化[9-10]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種多能細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)多種損傷后修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，bFGF不僅能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、自我更新和分化，而且可刺激肌腱Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成，有利于新生肌腱獲得更好的生物力學(xué)性能[11-12]。然而以上結(jié)論是基于間充質(zhì)干細(xì)胞的研究，bFGF對TDSC的作用和機(jī)制尚不明確。近年來，研究發(fā)現(xiàn)TDSC的生成與miRNA的差異表達(dá)相關(guān)[13]。有研究報(bào)道bFGF誘導(dǎo)的血管重塑通路主要調(diào)節(jié)miR-222[14]，在增生期，新血管形成是肌腱愈合的重要組成部分[15-16]。因此，本研究進(jìn)一步探討bFGF對大鼠TDSC增殖的影響，并探索bFGF是否能通過影響miR-222的差異表達(dá)來發(fā)揮肌腱損傷修復(fù)的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年（8～12周齡）SD大鼠10只。大鼠自由獲取食物和水，飼養(yǎng)在一個(gè)12 h光-暗循環(huán)的房間。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過1周適應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心審批通過。

1.2 試劑和儀器 大鼠TDSC完全培養(yǎng)基（批號(hào)：CMR165）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；FBS、胰酶、青霉素-鏈霉素溶液、PE-CD44抗體（批號(hào)：12-0441-82）、FITC-CD14 抗體（批號(hào)：11-0141-82）、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX均購自美國ThermoFisher Scientific公司。PE 標(biāo)記抗小鼠 IgG1（批號(hào)：553873）、FITC標(biāo)記抗小鼠IgG1（批號(hào)：562001）陰性對照抗體均購自美國BD公司；地塞米松（批號(hào)：D829854）、維生素C（批號(hào)：A800295）、β-甘油磷酸鈉（批號(hào)：G806967）、谷氨酰胺（批號(hào)：L810391）、胰島素（批號(hào)：I828365）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，批號(hào)：I811775）、吲哚美辛（批號(hào)：I811784）均購自麥克林試劑有限公司；NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）試劑盒及NovoStarSYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒均購自上海Novoprotein公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)：P0012S）、bFGF 大鼠重組蛋白（批號(hào)：P6348）、CCK-8試劑盒（批號(hào)：C0037）、油紅O 染色試劑盒（批號(hào)：C0157S）、成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒（茜素紅S法，批號(hào)：C0148S）及阿爾新藍(lán)-核固紅染色試劑盒（批號(hào)：C0155M）均購自碧云天生物科技有限公司；miR-222抑制劑miR-222 in由上海吉瑪公司合成；Attune NxT流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀（Multiskan-FC）均購自美國ThermoFisher Scientific公司；7500F實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；免疫印跡成像系統(tǒng)購自美國UVP公司。

1.3 大鼠TDSC的原代細(xì)胞培養(yǎng) 采用植塊法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，成年大鼠脊椎脫臼法處死后迅速浸入75%乙醇溶液中，取大鼠后足部位肌腱組織，肌腱均勻剪碎成1 mm3大小，用少量培養(yǎng)基重懸組織塊，置于培養(yǎng)皿中，置于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待10 d左右大量肌腱細(xì)胞游離出來以后，使用含3% FBS的大鼠TDSC完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每3～4 d換液1次，細(xì)胞的P1～P3代用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.4 TDSC中CD44+且CD14-細(xì)胞比例檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將5×105個(gè)P3代TDSC用300 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸，加入PE-CD44和FITC-CD14抗體，并設(shè)置同型對照管，室溫孵育45 min，PBS洗1次，12 000 g離心5 min，去上清液，500 μl結(jié)合緩沖液重懸后上流式細(xì)胞儀分析。

1.5 多向分化能力檢測 將P3代TDSC懸液以5×103個(gè)/cm2細(xì)胞濃度接種至6孔培養(yǎng)板中，至細(xì)胞完全融合，在TDSC完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別加不同誘導(dǎo)液，包括成脂肪誘導(dǎo)液（含10 mM 胰島素、500 μmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、400 mmol/L吲哚美辛），成骨誘導(dǎo)液（含1 nmol/L地塞米松、50 mmol/L維生素C、20mmol/L β-甘油磷酸鈉）和成軟骨誘導(dǎo)液（含0.5 μmol/L地塞米松、100 mg/L維生素C、10%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、50 mg/L脯氨酸、100 mg/ml丙酮酸）。同時(shí)取完全培養(yǎng)基作為對照組，每3 d換液1次。28 d后采用Western blot法分別檢測成脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白[過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）和脂肪酶（Adipsin）]、成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白[骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OC）和 ALP蛋白]和成軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白[聚集蛋白聚糖（aggrecan，Agg）、X型膠原蛋白（collagen type X，CollX）、Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Coll Ⅱ）]。同時(shí)對成脂細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色（具體方法參照碧云天油紅O染色試劑盒說明書），成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅S染色（具體方法參照碧云天成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒說明書），成軟骨細(xì)胞進(jìn)行阿爾新藍(lán)法染色（具體方法參見碧云天阿爾新藍(lán)-核固紅染色試劑盒說明書）。

1.6 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。培養(yǎng)皿放于冰上，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，冰上裂解細(xì)胞5 min，收集細(xì)胞裂解物，1 ml注射器吹打以破壞DNA。取3 μl進(jìn)行BCA蛋白定量，剩余樣本加入上樣緩沖液后95℃下孵育10 min，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?。制?0% SDS-PAGE凝膠，每孔加入40 μg蛋白，電泳分離蛋白質(zhì)后，恒定電流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗，4℃孵育過夜，加入內(nèi)參抗體β-actin并在室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜3次。加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。加入ECL發(fā)光溶液，并在UVP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，蛋白條帶通過Image J軟件進(jìn)行灰度值量化。

1.7 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后加入終濃度為 1、10、100、1 000、10 000 μg/L 的 bFGF，每組3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置不加bFGF的TDSC為對照孔。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入20 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞生長曲線，在TDSC中加入1 000 μg/L bFGF（bFGF組）后，以不做任何處理的TDSC作為對照組，分別于第1、3、5、7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 細(xì)胞克隆形成能力檢測 采用平板克隆形成法。細(xì)胞接種密度為500個(gè)細(xì)胞/cm2，對照組在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，bFGF組用含1 000 μg/L bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10 d后結(jié)晶紫染色，50個(gè)細(xì)胞以上為1個(gè)克隆，計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的正常TDSC，按5×105細(xì)胞/孔接種在6孔板中，分為TDSC組、TDSC+bFGF組、TDSC+miR-222 in組和 TDSC+bFGF+miR-222 in組4組。TDSC組（空白對照）在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；TDSC+bFGF組在含有1 000 μg/L bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；TDSC+miR-222 in組轉(zhuǎn)染miR-222 in后在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；TDSC+bFGF+miR-222 in組轉(zhuǎn)染miR-222 in后在含有1 000 μg/L bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用Lipofectamin RNAiMAX進(jìn)行轉(zhuǎn)染。第1、3、5、7天取出培養(yǎng)箱中的細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力（參照方法1.7），繪制細(xì)胞生長曲線。

1.10 miR-222表達(dá)水平檢測 采用qPCR法。用不同濃度 bFGF（0、100、500、1 000 μg/L）處理 TDSC 24 h，收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞RNA后，使用NovoScript1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按照NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒操作說明書檢測miR-222表達(dá)水平。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算miR-222的相對表達(dá)量，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測試。使用的引物如下：miR-222正向引物：5'-GCTCAGTAGCCAGTGTAG-3'，反向引物：5'-GAACAT GTCTGCGTATCTC-3'；U6 正向引物：5'-TGGAACGCT TCACGAATTTGCG-3'，反向引物：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。TDSC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222 in后的miR-222表達(dá)水平也依照上述方法進(jìn)行檢測。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)均單獨(dú)重復(fù)3次。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠TDSC的建立和鑒定 應(yīng)用植塊法在第3～4天即可看到有細(xì)胞從組織塊周圍生長出來；細(xì)胞培養(yǎng)第7天，即可在鏡下觀察到呈集落樣生長的TDSC，部分細(xì)胞細(xì)長，呈纖維狀；隨后在第20天細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期（圖1a-c）。流式細(xì)胞術(shù)檢測TDSC中CD44+且CD14-細(xì)胞比例為91.83%（圖1d）。對TDSC進(jìn)行成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)，結(jié)果顯示油紅O染色后有大量的油脂（紅色部位）生成（圖2a，見插頁）；對TDSC進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，結(jié)果顯示茜素紅S染色后有大量的鈣沉積（橙色部位）（圖2b，見插頁）；對TDSC進(jìn)行成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，結(jié)果顯示阿爾新藍(lán)染色后有大量的軟骨細(xì)胞陽性顯色（藍(lán)色部位）（圖2c，見插頁）。分別對對誘導(dǎo)后成脂肪細(xì)胞的標(biāo)志蛋白（PPAR-γ2、LPL、Adipsin）、成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白（OPN、OC、ALP）及成軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白（Agg、Coll X、Coll Ⅱ）進(jìn)行檢測，不同類型細(xì)胞標(biāo)志性蛋白均呈陽性表達(dá)，提示誘導(dǎo)分化成功（圖2d-f，見插頁）。

圖1 大鼠肌腱干細(xì)胞（TDSC）原代培養(yǎng)建立以及細(xì)胞純度分析（a-c：TDSC培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)；d：流式細(xì)胞分析TDSC中CD44+且CD14-細(xì)胞比例）

圖2 大鼠肌腱干細(xì)胞（TDSC）誘導(dǎo)分化為成脂肪、成骨和成軟骨細(xì)胞的能力[a：誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞后，油紅O染色確定細(xì)胞脂肪滴水平，×200；b：誘導(dǎo)成骨細(xì)胞后，茜素紅S染色確定細(xì)胞鈣沉積水平，×200；c：誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞后，阿利新藍(lán)染色檢測軟骨誘導(dǎo)效果，×200；d：成脂肪細(xì)胞相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和脂肪酶（Adipsin）表達(dá)的凝膠成像圖；e：成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OC）和ALP蛋白表達(dá)的凝膠成像圖；f：成軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白聚集蛋白聚糖（Agg）、Ⅹ型膠原蛋白（CollⅩ）、Ⅱ型膠原蛋白（Coll Ⅱ）表達(dá)的凝膠成像圖]

2.2 bFGF對大鼠TDSC增殖和克隆形成能力的影響bFGF可以刺激TDSC的增殖，當(dāng)1 000 μg/L bFGF作用于TDSC時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到最高，為160%，見圖3a。bFGF可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，第7天時(shí)細(xì)胞增殖水平達(dá)到最大，OD值為0.635±0.036，高于對照組的0.420±0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3b。bFGF 可促進(jìn)TDSC克隆形成，作用10 d后bFGF組形成更多的克?。▓D 3c）。bFGF 組克隆數(shù)為（75±4）個(gè)，多于對照組的（50±5）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3d。

圖3 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）對大鼠肌腱干細(xì)胞（TDSC）增殖和克隆形成能力的影響（a：不同濃度bFGF作用于TDSC后細(xì)胞增殖率比較；b：1 000 μg/L bFGF作用于TDSC后對細(xì)胞生長曲線的影響，與對照組比較，*P＜0.05；c：作用10 d后，bFGF對TDSC克隆形成能力的影響；d：bFGF組和對照組細(xì)胞克隆數(shù)比較，與對照組比較，*P＜0.05；OD為吸光度）

2.3 bFGF對miR-222過表達(dá)或抑制的TDSC的增殖能力和miR-222表達(dá)的影響 隨著bFGF濃度的增加，TDSC 中 miR-222相對表達(dá)量增加（P＜0.05）；與 0 μg/L比較，500、1 000 μg/L bFGF 處理后 TDSC 中 miR-222相對表達(dá)量均增加（均P＜0.05），見圖4a。miR-222 in可明顯降低TDSC中miR-222相對表達(dá)量（P＜0.05），見圖4b。與TDSC組比較，TDSC+miR-222 in組細(xì)胞增殖變慢，而TDSC+bFGF+miR-222 in組在加入bFGF后則可以恢復(fù)miR-222 in對細(xì)胞的抑制效應(yīng)，見圖4c。

圖4 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）對miR-222過表達(dá)或抑制的大鼠肌腱干細(xì)胞（TDSC）的增殖能力和miR-222表達(dá)的影響（a：不同濃度bFGF處理的TDSC中miR-222相對表達(dá)量比較，與0 μg/L比較，*P＜0.05；b：轉(zhuǎn)染miR-222 in后，qPCR檢測TDSC中miR-222相對表達(dá)量，與TDSC比較，*P＜0.05；c：加入bFGF和miR-222 in后對TDSC生長曲線的影響；OD為吸光度）

3 討論

TDSC是一種多能干細(xì)胞，在維持肌腱穩(wěn)態(tài)和恢復(fù)中發(fā)揮重要作用[17]。由于TDSC是肌腱組織的來源，因此特別適用于肌腱和肌腱-骨交界處的修復(fù)。此外，與其他組織分離的非造血成體干細(xì)胞相比，它們還具有更高的產(chǎn)量、集落形成能力、增殖能力和多向分化潛能。本研究中，使用地塞米松、維生素C等化合物誘導(dǎo)大鼠TDSC，誘導(dǎo)后可分別得到成脂肪、成骨、成軟骨細(xì)胞，說明大鼠TDSC具有較好的多向分化潛能。TDSC作為肌腱組織的固有細(xì)胞，可更好地適應(yīng)肌腱微環(huán)境，并優(yōu)先分化為肌腱細(xì)胞[18]。Guo等[17]發(fā)現(xiàn)，與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，TDSC可能有更好的肌腱組織特異性和分化特性。Chen等[19]研究結(jié)果表明，將新型殼聚糖支架植入TDSC可以加速肌腱愈合，為肌腱再生提供了一種基于干細(xì)胞的新策略。

近年來，研究人員嘗試將生長因子、細(xì)胞療法與傳統(tǒng)醫(yī)療手段相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)無瘢痕肌腱組織再生，擬解決成人肌腱在損傷后不能自我再生的問題。如利用生長分化因子5可促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的肌腱分化，轉(zhuǎn)化生長因子-β1和胰島素樣生長因子-1可增加TDSC的增殖并有利于表型維持。bFGF在損傷肌腱處初始愈合過程中升高，這預(yù)示著bFGF可能在肌腱愈合的早期發(fā)揮重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，bFGF可以刺激TDSC的增殖，與未加bFGF的TDSC相比，最高可達(dá)到160%的增殖率。同時(shí)bFGF也促進(jìn)了TDSC的克隆形成能力，克隆形成能力主要反映單個(gè)細(xì)胞增殖能力，一定程度上可以反映細(xì)胞存活能力。目前關(guān)于bFGF對TDSC的增殖影響研究較多[21-22]，但其具體發(fā)揮作用的機(jī)制尚不完全清楚。

近年來的研究表明，miRNA在干細(xì)胞分裂和分化中起著至關(guān)重要的作用。例如，miR-138和miR-23b[23]在干細(xì)胞成骨和成軟骨自我更新和分化過程中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長因子通過抑制microRNA-205-5p的表達(dá)促進(jìn)肩袖撕裂肌腱骨愈合[24]。但關(guān)于bFGF是否是通過調(diào)控miR-222來促進(jìn)TDSC增殖的相關(guān)研究還未見報(bào)道。研究顯示，miR-222在bFGF誘導(dǎo)的血管重塑通路中主要調(diào)節(jié)miRNA[14]。同時(shí)miR-222可影響人造血干細(xì)胞分化[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，bFGF可上調(diào)miR-222表達(dá)，如果抑制miR-222表達(dá)，則會(huì)削弱由bFGF誘導(dǎo)的促細(xì)胞增殖作用。本研究結(jié)果提示，bFGF通過上調(diào)miR-222促進(jìn)大鼠TDSC的增殖能力，miR-222可能在大鼠TDSC增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，bFGF/miR-222可能是肌腱修復(fù)發(fā)展過程中的重要途徑，可能成為肌腱損傷修復(fù)治療的新靶點(diǎn)。