張麗鳳，梁祚仁，廖素嬋，莫頌軼，黃彥峰，黎昀，余雙全，黃俊杰

(右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

長期過量飲酒或酗酒可以引起慢性酒精中毒，影響記憶力、認(rèn)知功能等。五味子乙素(Schisandrin B，Sch B)是中藥五味子中有效成分，研究表明它有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用[1]。但五味子乙素對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的研究尚未見報道。本研究通過觀察Sch B對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，探討Sch B對酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗試劑及儀器 Wistar大鼠購買于長沙天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(湘)2019-0014]，雄性，體重180～200 g，實驗動物的操作經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)同意后實施。五味子乙素(維克奇生物科技公司)，電鏡固定液(Servicebio公司)，透射電子顯微鏡(HITACHI公司)，Morris 水迷宮(北京新天地科技有限公司)，超薄切片機(jī)(Leica公司)，光學(xué)顯微鏡(Leica公司)。

1.2 動物分組及慢性酒精中毒模型建立 25只Wistar大鼠，隨機(jī)分成5組：空白對照組、酒精中毒模型組、Sch B低劑量組、Sch B中劑量組、Sch B高劑量組，每組5只?？瞻讓φ战M每天用蒸餾水灌胃，其余4組每天給予56°北京紅星二鍋頭白酒(8 ml/kg)灌胃，連續(xù)8周，建立慢性酒精中毒動物模型。Sch B低劑量組、Sch B中劑量組、Sch B高劑量組再繼續(xù)給予Sch B灌胃，各組灌胃劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg，每日1次，連續(xù)Sch B灌胃30 d。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力評價 按參考文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行Morris水迷宮實驗，將大鼠面向池壁放入水中，訓(xùn)練大鼠找到平臺的時間即潛伏期，以4 d為訓(xùn)練期訓(xùn)練。第5天開始試驗，記錄動物在60 s內(nèi)第一次經(jīng)過站臺所用時間即潛伏期，電腦采集圖像、描繪運(yùn)動軌跡，并進(jìn)行分析。

1.4 光鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 海馬組織10%福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片后進(jìn)行HE染色，用顯微鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)改變并拍照采集圖片。

1.5 透射電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 海馬組織放入固定液中，經(jīng)切片、染色后，采用透射電子鏡觀察各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化并拍照采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 Sch B對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 訓(xùn)練第3天、第4天，模型組的潛伏期比空白對照組的潛伏期均明顯增長(P<0.05)，Sch B高劑量組的潛伏期比模型組的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，見表1。從采集的運(yùn)動軌跡圖看出，酒精中毒組大鼠運(yùn)動軌跡偏離平臺，趨向性較差，探索軌跡單一，且在目標(biāo)象限運(yùn)動軌跡明顯減少，多呈邊緣化運(yùn)動。而Sch B各濃度組運(yùn)動軌跡趨向原平臺所在的目標(biāo)象限位置，在目標(biāo)象限探索時間及路程都比模型組明顯增加(見圖1)。經(jīng)過前期記憶訓(xùn)練，大鼠在規(guī)定時間內(nèi)其運(yùn)動軌跡單一，且偏離目標(biāo)象限，說明大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙，相反，在規(guī)定時間內(nèi)，大鼠趨向目標(biāo)方向運(yùn)動軌跡多，說明大鼠尋找目標(biāo)物體的記憶功能得到提高。

表1 Morris水迷宮定位航行實驗訓(xùn)練潛伏期結(jié)果

圖1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗游泳路徑軌跡比較

2.2 光鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 空白對照組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊、無變性；模型組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，染色質(zhì)深染，大量神經(jīng)細(xì)胞胞核異形。而Sch B低、中、高劑量組結(jié)構(gòu)異常較輕，損傷數(shù)量減少，以中、高劑量組顯著表現(xiàn)[3]，見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)病理改變(×400)

2.3 透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變 空白對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞膜完整，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)均勻，核膜清晰、完整；而酒精中毒組的神經(jīng)細(xì)胞胞膜破損，細(xì)胞呈不同程度水腫，細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊集。通過Sch B干預(yù)后，Sch B 低、中劑量組神經(jīng)元細(xì)胞呈輕度水腫，細(xì)胞膜局部破損，染色質(zhì)輕度溶解，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，局部齒狀凹陷；與Sch B 低、中劑量組比較，Sch B 高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞水腫減輕，細(xì)胞膜較為完整，細(xì)胞損傷面積減少、損傷程度降低，細(xì)胞核完整、核膜清晰，染色質(zhì)均勻(見圖3)。

圖3 透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞(×1500)

3 討論

過量攝入酒精對健康有害，長期過量飲酒或酗酒可以引起慢性酒精中毒，酒精能通過血腦屏障作用于腦組織，其與神經(jīng)細(xì)胞膜有較高親和性，進(jìn)而影響與記憶相關(guān)腦區(qū)及其功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷，同時，還將累及機(jī)體的多器官多系統(tǒng)損害：如神經(jīng)心理認(rèn)知功能障礙、肝臟的損傷等等[4-5]。慢性酒精中毒主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力減退、認(rèn)知和判斷的障礙等，目前其機(jī)制尚未完全闡明清楚，對其預(yù)防和治療也沒有特效藥。

本研究用連續(xù)用白酒灌胃8周制備慢性酒精中毒大鼠模型，中毒大鼠潛伏期長，運(yùn)動軌跡偏離平臺，在目標(biāo)象限運(yùn)動軌跡明顯減少，出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙。大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，大量神經(jīng)元胞核異形，染色質(zhì)深染；神經(jīng)元細(xì)胞膜破損，細(xì)胞呈不同程度水腫，細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊集。說明酒精中毒引起腦組織的損傷和神經(jīng)系統(tǒng)功能的損害。酒精中毒不僅使大腦結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酒精還對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性興奮作用，從而使神經(jīng)元系統(tǒng)突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量以及突觸受體構(gòu)形發(fā)生改變，導(dǎo)致認(rèn)知功能損害[4，6]。

慢性酒精中毒大鼠通過用Sch B連續(xù)灌胃30 d后，大鼠運(yùn)動軌跡探索目標(biāo)方向明確，在目標(biāo)象限探索時間及路程都比模型組明顯增加，說明Sch B能提高酒精中毒大鼠尋找目標(biāo)物體的記憶功能，可以增強(qiáng)酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)和記憶。顯微形態(tài)學(xué)觀察到Sch B各濃度組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞膜較為完整，神經(jīng)細(xì)胞水腫減輕，神經(jīng)元損傷數(shù)量和損傷程度較酒精中毒模型組有明顯減少。五味子是一種含多種活性成分的木蘭科植物，有甲素、乙素、醇甲、醇乙、酮、酚等活性成分，其中以五味子乙素含量最高，其具有保護(hù)大腦神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶的作用[7]。其作用機(jī)制可能Sch B通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，改善神經(jīng)細(xì)胞線粒體抗凋亡作用，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高學(xué)習(xí)記憶[8]；Sch B也能提高海馬組織中PSD-95和SYN蛋白表達(dá)，減輕突觸小體水腫程度，使突觸間隙清晰、突觸后致密區(qū)增厚及突觸數(shù)量增加，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力[9-10]，這可能也是Sch B對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶影響作用的機(jī)制之一。

綜上所述，五味子乙素減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。但其詳細(xì)的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。