閆楚凡 韓笑 張勁松

中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110059

糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障多見于全身或局部長期使用糖皮質(zhì)激素者，其發(fā)病機制尚未完全闡明。許多生物學過程被證明與糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)，如細胞分化異常和糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的激活等[1-3]；糖皮質(zhì)激素還導致晶狀體中E鈣黏附蛋白和N鈣黏附蛋白的表達量下降，而細胞黏附在晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)的正常分化和遷移中有重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度為18～22個核苷酸的非編碼RNA，與基因的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，通過抑制基因的轉(zhuǎn)錄來影響蛋白的表達。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a可以靶向抑制GR mRNA的表達，同時其本身的表達量又依賴于GR的激活，形成一個負反饋回路，這個特點在糖皮質(zhì)激素治療過程中有助于減緩GR水平的逐漸降低[5]，這為糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的治療提供了新的思路。目前關(guān)于miRNA與糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的研究尚未見報道。本研究基于生物信息學方法分析經(jīng)地塞米松處理的LECs中差異基因的表達及其相關(guān)的生物學功能，篩選并驗證hub基因的表達，預(yù)測與其最有可能相關(guān)的miRNA，以期為白內(nèi)障的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人LECs細胞株HLE-B3細胞購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑及儀器 地塞米松、Trixon X-100(北京索萊寶科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司)；MEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；胎牛血清(澳洲AusGeneX公司)；青鏈霉素混合液(美國HyClone公司)；RNA iso Plus、實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛(武漢博士德生物工程有限公司)；甘氨酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；mRNA引物(武漢金開瑞生物工程有限公司)；EdU細胞增生檢測試劑盒(廣州銳博科技有限公司)。PCR逆轉(zhuǎn)錄儀(美國Bio-Rad公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 不同生物信息學方法對地塞米松處理的HLE-B3細胞生物學功能的評估

1.2.1GEO2R法分析HLE-B3細胞差異基因 從公開數(shù)據(jù)庫GEO中下載GSE3040數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由Gupta等[6]上傳。該數(shù)據(jù)集中，用DMSO處理的HLE-B3細胞設(shè)置為對照組，經(jīng)過1 μmol/L地塞米松處理16 h的HLE-B3細胞設(shè)置為實驗組，每組3個樣本。通過Affymetrix Human Genome U133A Array平臺，得到不同樣本間基因表達數(shù)據(jù)。參照文獻[7]的方法，利用GEO數(shù)據(jù)庫的生信分析工具GEO2R，以倍數(shù)變化>2、P值<0.05為條件篩選分析2個組間差異基因的表達。利用graphGP網(wǎng)站(https://www.ehbio.com/ImageGP/)，以logFC為橫坐標、-log10(Pvalue)為縱坐標繪制該數(shù)據(jù)集差異基因的火山圖。藍色代表下調(diào)基因，紫色代表上調(diào)基因，黃色代表表達無差異的基因。

1.2.2利用Metascape網(wǎng)站進行差異基因功能富集分析 打開Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/gp/index.html/)[8]，將之前得到的差異基因名稱或者基因ID輸入基因列表并提交，即可獲取功能富集柱圖。所有富集到的詞條來源于GO生物學過程、KEGG通路、Reactome基因集、Canonical通路及CORUM。收集P值<0.01、最小計數(shù)為3、富集因子>1.5的項，并根據(jù)成員的相似性進行分組。在對豐富項進行層次聚類時，采用Kappa分數(shù)作為一致性度量，一致性>0.3的子樹作為1個聚類，選擇集群中最具統(tǒng)計意義的術(shù)語來表示集群。

1.2.3作圖法分析hub基因 利用STRING數(shù)據(jù)庫(v10.5,https://string-db.org/cgi/input.pl)獲得差異基因相互關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導入cytoscape軟件[9]，分析并制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，在cytoscape中安裝cytohubba app，選擇MCC方法分析前25位hub基因及其相互關(guān)系，顏色越深表示基因重要性越高。

1.2.4mirCode預(yù)測與hub基因相關(guān)的miRNA 在mirCode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org)[10]中下載已知的高度保守的miRNA數(shù)據(jù)集，篩選出可能與前10個hub基因有調(diào)控關(guān)系的miRNA，利用cytoscape軟件，制作出預(yù)測的hub基因與miRNA的調(diào)控網(wǎng)狀圖。藍色六邊形點代表篩選出的關(guān)鍵hub基因，紫色圓點是與其相關(guān)的miRNA。

1.3 地塞米松處理后HLE-B3細胞生物學功能變化的離體細胞實驗

1.3.1細胞培養(yǎng)及分組 將凍存的HLE-B3細胞從-80 ℃冰箱中取出，迅速將凍存管放到37 ℃水浴鍋中輕輕搖晃解凍1～2 min，置于低速離心機中，離心半徑16 cm，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。用1 ml完全培養(yǎng)基重懸細胞并將其均勻接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，添加3 ml完全培養(yǎng)基。置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2溫箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%～90%時用胰蛋白酶消化并1∶ 3傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞(第3代及以后的細胞)，分別加入1 μmol/L DMSO和1 μmol/L地塞米松，置于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)16 h，作為對照組和實驗組，進行后續(xù)實驗。

1.3.2EdU實驗檢測HLE-B3細胞增生情況 取處于對數(shù)生長期的HLE-B3細胞接種至96孔板中，分別設(shè)置實驗組和對照組，每組3個復孔。用完全培養(yǎng)基按1 000∶ 1稀釋EdU溶液，終濃度為50 μmol/L，每孔加入100 μl該培養(yǎng)基，溫箱孵育2 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，每次5 min。每孔加入4%多聚甲醛50 μl室溫下固定30 min，棄固定液，每孔加入質(zhì)量濃度2 mg/ml甘氨酸50 μl，脫色搖床孵育5 min后棄液，每孔加入100 μl PBS，脫色搖床清洗5 min后棄液。每孔加入100 μl體積分數(shù)0.5% TrixonX-100脫色搖床孵育10 min，PBS清洗1次，5 min。每孔加入100 μl Apollo染色反應(yīng)液，避光室溫搖床孵育30 min后棄液(之后步驟均避光進行)，每孔加入0.5% Trixon X-100各100 μl，搖床清洗2次，每次10 min。每孔加入100倍稀釋Hoechst33342各50 μl，室溫下孵育5 min復染核，PBS清洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察染色情況，綠色熒光染色細胞為增生期細胞，藍色熒光染色細胞為活細胞。細胞增生率=增生期細胞數(shù)/活細胞數(shù)×100%。

1.3.3實時熒光定量PCR檢測hub基因相對表達量 采用Trizol法分別提取實驗組和對照組HLE-B3細胞的RNA，分光光度計測定RNA的濃度和純度，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，前10個hub基因的引物序列見表1。采用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時熒光定量PCR實驗，按照試劑盒說明書步驟進行實驗。實驗條件：96 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環(huán)，添加熔解曲線。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

表1 糖皮質(zhì)激素處理HLE-B3細胞中排名前10位hub基因的引物序列Table 1 The primer sequence of top 10 hub genes in glucocorticoid treated HLE-B3 cells引物名稱序列(5’-3’)SST正向:CTCCCTCGGACCCCAGACTC反向:AGGGCATCATTCTCCGTCTGGCXCL8正向:AGCTCTGTGTGAAGGTGCAGT反向:TGGGGTGGAAAGGTTTGGAGTGRM1正向:CCTCTGATGTTGTCCGCATGC反向:CCCCTGCCTTCTTTCTTCGGAGNRH1正向:TCTACTGACTTGGTGCGTGGA反向:CGTTGGGTTTCTGCCAGTTGACXCL5正向:GCTGCGTTGCGTTTGTTTACA反向:CGTTCTTCAGGGAGGCTACCAGRK5正向:GACCCTCCCTTCGTTCCAGAC反向:ATTGACGCCCTTCACAGTGGAPPBP正向:GGAAGTGATCGGGAAAGGAAC反向:ATCTGGGTCCAGGCAGATTTTCX3CR1正向:ACAGCAAGAAGCCCAAGAGTG反向:AGGGCAAAGTGGCTACAAACAPYY正向:AGGAGCTGAACCGCTACTACG反向:GGGGAAGAACGTTTTGGAAAGEDNRA正向:GATCACCGTCCTCAACCTCTG反向:AAAGGAATCCCAATTCCCTGA

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0和Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。計量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示；實驗組和對照組中的SST、CXCL8、GRM1、GNRH1、CXCL5、PPBP、CX3CR1、PYY、EDNRA、GRK5的mRNA相對表達量差異比較，以及HLE-B3細胞增生值差異比較均采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松作用后LECs中差異基因的篩選

通過GEO2R分析數(shù)據(jù)，得到341個差異基因，其中上調(diào)基因為300個，下調(diào)基因為41個。下調(diào)基因中差異最顯著的5個基因是SLC12A1、MED13L、ALDH5A1、SLC15A3和WWC1基因；上調(diào)基因中差異最顯著的5個基因是SCNN1A、ANKRD36、FKBP5、PYY和ADH1B基因(圖1)。

圖1 HLE-B3細胞差異基因表達火山圖 藍色代表在糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障中表達下調(diào)的基因，紫色代表糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障中表達上調(diào)的基因，黃色代表表達無差異的基因Figure 1 Volcano plot of differentially expressed genes in HLE-B3 cell Blue spots represented the down-regulated genes and purple spots represented the up-regulated genes,and yellow spots represented the genes without statistic difference in expression level in glucocorticoid induced cataract

2.2 地塞米松作用后2個組HLE-B3細胞增生值比較

HLE-B3細胞差異基因生物學功能富集分析列出了341個差異表達基因富集量最多的前20個詞條，結(jié)果顯示富集量最大的是對HLE-B3細胞增生的負向調(diào)節(jié)[-log10(P)=5.73]，第2和第3分別是細胞對脂多糖的反應(yīng)[-log10(P)=5.14]和細胞外基質(zhì)的降解[-log10(P)=5.12](圖2)。EdU細胞增生實驗結(jié)果顯示，實驗組細胞增生率為(8.09±0.20)%，明顯低于對照組的(39.63±0.80)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=38.43，P<0.01)(圖3)。

圖2 HLE-B3細胞差異基因生物學功能富集分析 列出341個差異基因富集到的前20個詞條Figure 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes in HLE-B3 cell The top 20 terms in functional enrichment analysis among 341 differentially expressed genes

圖3 EdU細胞增生實驗檢測地塞米松對HLE-B3細胞增生的調(diào)控作用 A：實驗組和對照組細胞染色(標尺=100 μm) 藍色代表細胞核，綠色代表增生期細胞 B：實驗組與對照組LECs增生率比較 與對照組比較，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=3)Figure 3 The effect of dexamethasone on HLE-B3 cell proliferation tested by EdU proliferation assay A:Staining results of the experimental group and control group(bar=100 μm) Blue spots represented cell nuclei,and green spots represented cells in proliferation B:Comparison of LECs proliferation rate between the two groups Compared with the control group,aP<0.01(Independent-samples t test,n=3)

2.3 地塞米松作用后2個組HLE-B3細胞中hub基因mRNA相對表達量比較

排名前10位的hub基因分別為SST、CXCL8、GRM1、GNRH1、CXCL5、PPBP、CX3CR1、PYY、EDNRA和GRK5基因，其中唯一下調(diào)的是GRK5基因，其余表達均上調(diào)(圖4)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在得到的10個hub基因中，實驗組HLE-B3細胞中SST、CXCL8、GRM1、PYY和EDNRA mRNA相對表達量較對照組明顯升高，CXCL5和GRK5 mRNA的相對表達量較對照組明顯降低，2個組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；2個組GNRH1、PPBP和CX3CR1 mRNA相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(表2)。

圖4 hub基因及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 A：糖皮質(zhì)激素處理HLE-B3細胞中的hub基因 基因的顏色由紅變黃，代表重要性逐漸降低 B：差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 紫色的點代表在糖皮質(zhì)激素處理HLE-B3細胞中表達上調(diào)的基因，藍色的點代表表達下調(diào)的基因 圖5 與hub基因相關(guān)的miRNAs 藍色六邊形點代表篩選出的hub基因，紫色圓點代表與其相關(guān)的miRNAFigure 4 Hub genes and protein-protein interaction network A:Hub genes in glucocorticoid treated HLE-B3 cells The spots color changed from red to yellow,which meant the importance of genes gradually decreased B:Protein-protein interaction network of differentially expressed genes Purple spots represented the up-regulated genes and blue spots represented the down-regulated genes in the glucocorticoid-treated HLE-B3 cells Figure 5 The miRNAs associated with hub genes The blue hexagons represented hub genes,and purple spots represented miRNAs related to them

表2 2個組HLE-B3細胞中前10位hub基因mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative mRNA expression levels of top 10 hub genes in HLE-B3 cells between the two groups (mean±SD)組別樣本量不同基因mRNA相對表達量SSTCXCL8GRM1GNRH1CXCL5GRK5PPBPCX3CR1PYYEDNRA對照組31.02±0.131.00±0.061.00±0.061.03±0.161.00±0.061.02±0.151.06±0.251.00±0.011.36±0.081.05±0.21實驗組32.09±0.121.53±0.112.08±0.350.60±0.030.47±0.120.26±0.020.80±0.020.97±0.044.35±0.097.17±1.56t值5.9924.1683.0412.5694.0515.1141.0260.79225.1903.882P值0.0040.0140.0380.0600.0150.0070.3630.473<0.010.017 注:獨立樣本t檢驗 Note:Independent-samples t test

2.4 HLE-B3細胞中與hub基因相關(guān)的miRNA預(yù)測

mirCode預(yù)測結(jié)果顯示，與hub基因關(guān)聯(lián)最密切的前6位miRNA分別是miR-15abc、miR-214、miR-23abc、miR-129-5p、miR-132和miR-24(圖5)。

3 討論

隨著糖皮質(zhì)激素越來越廣泛地應(yīng)用于臨床，糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障患病人數(shù)也逐漸增多，早在1960年就有研究者發(fā)現(xiàn)在長期使用糖皮質(zhì)激素治療風濕性關(guān)節(jié)炎的患者中，有39%在治療過程中出現(xiàn)后囊下白內(nèi)障[11]。單一的基因表達差異不足以解釋疾病形成的原因。本研究通過高通量測序獲得基于糖皮質(zhì)激素作用于人HLE-B3細胞的差異基因，從而模擬糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的發(fā)病過程中基因表達的數(shù)據(jù)。利用現(xiàn)有的生物分析工具，分析出大量有表達差異的基因及其之間的相互作用關(guān)系，以及具體影響了哪些生物學功能。

既往研究多認為，糖皮質(zhì)激素通過促進LECs向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，從而導致后囊下白內(nèi)障的形成，且其發(fā)生率隨著糖皮質(zhì)激素劑量的增加而升高[12]。本研究通過差異基因的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L地塞米松很可能會抑制HLE-B3細胞的增生，并通過EdU實驗證實了這一點。之前有研究表明低濃度(100 nmol/L)的地塞米松可以促進LECs的增生[3]，由此可以推測隨著地塞米松濃度的增加，其逆轉(zhuǎn)了對細胞增生的調(diào)控作用。晶狀體由LECs和其分化而來的纖維細胞構(gòu)成，后囊下白內(nèi)障主要由LECs過度增生及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化異常造成。既往研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠抑制鼠晶狀體上皮外植體中LECs的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]，本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠抑制LECs增生，因此其有可能應(yīng)用于白內(nèi)障的治療。

已有研究發(fā)現(xiàn)，SST基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變和黃斑水腫患者玻璃體中表達減低[14-15]；CXCL8基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者房水中的表達水平遠高于無視網(wǎng)膜病變糖尿病患者，它能介導白細胞的激活與血管內(nèi)皮細胞的黏附[16]；CXCL5基因在干眼患者淚液中的表達量升高[17]；GRK5基因可以促進視紫紅質(zhì)磷酸化，導致夜盲[18]；PPBP基因的表達量在視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者玻璃體中顯著升高[19]；CX3CR1基因可以調(diào)控小膠質(zhì)細胞介導的光感受器的退化，是視網(wǎng)膜色素變性的潛在治療靶點[20-21]；阻斷EDNRA基因可以抑制病理性新生血管生成，并提高早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變患者的視力[22]；但GRM1、GNRH、PYY和F2RL3尚未見在眼科學領(lǐng)域的研究報道。本研究中排名前10位的hub基因在白內(nèi)障以及糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障中均無具體研究，它們能否延緩疾病的發(fā)生或治療糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障還有待進一步探討；同時，糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的hub基因多與視網(wǎng)膜疾病相關(guān)，2種疾病之間是否有相互關(guān)系，目前仍不清楚。

許多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在疾病的發(fā)生和發(fā)展中十分重要，目前一些miRNA相關(guān)藥物已進入臨床前試驗和臨床試驗階段，如miR-34模擬物用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤已進入I期臨床試驗階段，它還可以抑制肺癌、肝癌的生長[23]。在小鼠非小細胞肺癌模型中發(fā)現(xiàn)，miR-200模擬物可以增強輻射敏感度并延長小鼠的生存時間[24]，提示miRNA可以作為治療疾病的新靶點。本研究預(yù)測出與hub基因相關(guān)的miRNA目前均未在激素性白內(nèi)障中有具體研究，但在高糖誘導的LECs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型中，miR-214的表達量顯著下降，山奈酚和lncRNA PVT1都可以通過靶向調(diào)節(jié)miR-214來調(diào)控LECs的增生和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25-26]；經(jīng)過正常晶狀體與白內(nèi)障晶狀體測序?qū)Ρ群蟀l(fā)現(xiàn)，miR-23在透明晶狀體中的表達水平高于白內(nèi)障晶狀體[27]；過表達miR-24直接作用于p53基因，促進LECs凋亡[28]。

綜上所述，本研究篩選了糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障模型中的差異基因并進行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)1 μmol/L地塞米松能夠顯著抑制HLE-B3細胞增生，通過實驗驗證前10位hub基因中有6個與分析結(jié)果相符，同時預(yù)測了與糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障最有可能相關(guān)的6個miRNA，可以作為下一步研究糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的具體指標。需要說明的是，本研究為離體細胞學研究，并非來自在體模型，如動物模型和人體標本研究，研究結(jié)果是否與在體研究一致尚不清楚，仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突