劉 慶，李化強(qiáng)，吳菲菲，王美英 ，彭 潔，胡 平

(1. 邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000； 2. 廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東省教育廳食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)/廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 茂名 525000)

突隔梅花草(ParnassiadelavayiFranch.)，別稱(chēng)肺心草[1]，形態(tài)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[2]，為虎耳草科梅花草屬，對(duì)光照和土壤條件要求較低，能在海拔1 800～3 800 m的林下生長(zhǎng)迅速，主要產(chǎn)于湘、滇、川等地。 突隔梅花草具有清熱潤(rùn)肺，消腫止痛等作用，傳統(tǒng)中醫(yī)將其用于治療肺癆等疾病[3-4]，研究表明肺結(jié)核患者病情的嚴(yán)重程度與體內(nèi)氧化-抗氧化作用失衡程度有關(guān)，抗氧化活性物質(zhì)在治療肺結(jié)核過(guò)程中起著重要作用[5-7]。但是，目前對(duì)突隔梅花草的藥用成分及活性機(jī)制研究較少，僅陳珊[8]、吳丁[9]和Yang等人[10]對(duì)突隔梅花草傳粉、葉表皮以及物種鑒別進(jìn)行了研究，未涉及抗氧化物質(zhì)的提取和活性檢測(cè)。因此，為了進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)突隔梅花草，本研究從突隔梅花草中提取多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化突隔梅花草多糖的超聲輔助提取工藝，并測(cè)定體外抗氧化活性，為突隔梅花草開(kāi)發(fā)成保健食品和藥品提供理論依據(jù)。

圖1 突隔梅花草Fig. 1 P. delavayi

1 材料與儀器

1.1 材料

突隔梅花草，購(gòu)于邵陽(yáng)市寶慶大藥房；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度97%，生工生物工程上海股份有限公司)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，純度98%，生工生物工程上海股份有限公司)；其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器

ZN-1000A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(中南制藥機(jī)械廠(chǎng))；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-1780紫外分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)；VELOCITY 14R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(南京博惠科學(xué)儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 樣品的制備

將干燥的突隔梅花草的莖葉(含水量<5%)粉碎過(guò)40目篩孔，參照Z(yǔ)hu等人[11]的方法，稱(chēng)量4.00 g突隔梅花草于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為6.5～7.5，在不同條件下進(jìn)行超聲，將提取液以11 000 r/min離心10 min，收集上清液，并真空抽濾去除不溶性殘余物。將上清液濃縮，4℃下醇沉12 h，以7 000 r/min離心10 min，取沉淀物50℃烘干至恒重，得到多糖。計(jì)算多糖得率：

其中m0為干燥的多糖重量(g)；m為干燥的原料重量(g)。

2.2 單因素試驗(yàn)

以液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度為考察因素，其中液料比：10、15、20、25、30 mL/g；超聲時(shí)間：20、40、60、80、100 min；超聲功率：120、150、180、210、240 W；超聲溫度：30、40、50、60、70℃。以突隔梅花草多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

2.4 突隔梅花草多糖抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 Fe3+還原力的測(cè)定

參照楊碩等人[12]的方法，以抗壞血酸(VC)作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)不同濃度突隔梅花草多糖樣品液的還原力，按照下式計(jì)算：

還原力=Ai-A0

式中：Ai為樣品反應(yīng)后的吸光度；A0為空白對(duì)照的吸光度。

2.4.2 DPPH·清除能力的測(cè)定

參照姜洪芳等人[13]的方法，以VC作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)不同濃度突隔梅花草多糖樣品液的DPPH·清除能力，按照下式計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ai為樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為無(wú)水乙醇代替DPPH的吸光度。

2.4.3 ABTS+·清除能力的測(cè)定

參照Chen[14]的方法，以VC作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)不同濃度突隔梅花草多糖樣品液的ABTS+·清除能力，按照下式計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ai為樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度

2.4.4 ·OH清除能力的測(cè)定

參照曹穩(wěn)根等人[15]的方法，以VC作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)不同濃度突隔梅花草多糖樣品液的·OH清除能力，按照下式計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ai為樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為蒸餾水代替雙氧水溶液的吸光度。

2.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均平行3次，用SPSS 19.0軟件分析顯著性和計(jì)算IC50，用Design Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析，用Origin 2017軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 液料比對(duì)多糖得率的影響

如圖2a所示，在超聲時(shí)間60 min、超聲溫度50℃、超聲功率150 W的條件下，多糖得率呈先增大后趨于平緩的趨勢(shì)，液料比20 mL/g與25 mL/g相比差異不顯著，因此，選擇液料比為20 mL/g。

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖2b可知，隨超聲時(shí)間的增加，多糖得率變化呈倒鐘形，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的提取引起了多糖的降解[16]，從而超聲時(shí)間超過(guò)60 min后多糖得率降低，超聲時(shí)間60 min與40 min、80 min相比差異顯著。因此，最佳超聲時(shí)間為60 min。

3.1.3 超聲功率對(duì)多糖得率的影響

從圖2c中可以看到，隨著超聲功率的增加，多糖的得率呈先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為150 W時(shí)，得率最大(4.97%)?？赡芤?yàn)殡S著超聲功率的增大細(xì)胞破碎，使多糖溶出率增大，但當(dāng)超聲功率超過(guò)150 W時(shí)，功率過(guò)大使多糖分解，因此最佳提取功率為150 W。

3.1.4 超聲溫度對(duì)多糖得率的影響

如圖2d所示，在超聲溫度30～70℃范圍內(nèi)，多糖得率顯著增加隨后趨于平緩，這可能是由于溫度升高，分子動(dòng)能增大，使得多糖溶出率增大，但溫度超過(guò)60℃時(shí)，多糖溶出率趨于平衡。因此，選擇60℃為最佳超聲溫度。

圖2 液料比(a)，超聲時(shí)間(b)，超聲功率(c)和超聲溫度(d)對(duì)多糖得率的影響Fig. 2 The effect of liquid material ratio (a), ultrasonic time (b), ultrasonic power (c) and ultrasonic temperature (d) on the yield of polysaccharide 注：同一柱狀圖中不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，響應(yīng)面曲面圖見(jiàn)圖3。

突隔梅花草多糖得率(Y)對(duì)超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)和液料比(D)的二次多項(xiàng)回歸模型：Y(%)=5.52+0.49A+0.10B+0.022C+0.37D-0.10AB-0.089AC+0.092AD-0.020BC-0.072BD-0.020CD-0.23A2-0.11B2-0.30C2-0.22D2

表2 多糖提取工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and resultsof polysaccharide extraction experiments

續(xù)表2 多糖提取工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and resultsof polysaccharide extraction experiments

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression model

3.2.2 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取條件：液料比25 mL/g，超聲時(shí)間53.57 min，超聲溫度70℃，超聲功率145.89 W，多糖得率的預(yù)測(cè)值為6.03%。根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后條件：液料比25 mL/g，超聲時(shí)間54 min，超聲溫度70℃，超聲功率147 W，多糖得率的試驗(yàn)值為6.01%，相對(duì)誤差為0.32%，表明優(yōu)化的工藝參數(shù)可靠。

3.3 突隔梅花草多糖抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

3.3.1 Fe3+還原力的測(cè)定

突隔梅花草多糖的Fe3+還原力見(jiàn)圖4a。在Fe3+還原力測(cè)定中，吸光度越大，還原力越強(qiáng)。在0～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，突隔梅花草多糖和VC質(zhì)量濃度與鐵還原力與成正比，但突隔梅花草多糖的鐵還原力低于VC。

圖3 各因素響應(yīng)面分析圖Fig. 3 Response surface analysis diagram of each factor注：A.超聲溫度；B.超聲時(shí)間；C.超聲動(dòng)率；D.料液比

3.3.2 DPPH·清除能力的測(cè)定

突隔梅花草多糖的DPPH·清除能力見(jiàn)圖4b。在0～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，突隔梅花草多糖對(duì)DPPH·的清除能力隨之增加。當(dāng)濃度為20 μg/mL時(shí)，VC對(duì)DPPH·的清除能力接近100%，說(shuō)明VC的純度良好。當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，突隔梅花草多糖對(duì)DPPH·清除能力達(dá)到76.82%，其IC50為39.18 μg/mL。

田崇梅[17]和何念武等人[18]采用超聲輔助提取技術(shù)分別提取了蒙古黃芪多糖和灰灰菜多糖，并研究了提取物對(duì)DPPH·的清除能力。結(jié)果表明，IC50分別為1.14 mg/mL和1.899 mg/mL，可以比較出突隔梅花草多糖的DPPH·清除能力較好，這可能由于突隔梅花草具有清熱潤(rùn)肺，治療肺結(jié)核作用[3]，從而抗氧化效果良好。

3.3.3 ABTS+·清除能力的測(cè)定

突隔梅花草多糖的ABTS+·清除能力見(jiàn)圖4c。在0～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，突隔梅花草多糖對(duì)ABTS+·的清除能力呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度為25 μg/mL時(shí)，突隔梅花草多糖對(duì)ABTS+·的清除能力接近VC，達(dá)到94.22%，IC50為11.68 μg/mL。

龐丹清[19]和熊磊[20]等人對(duì)超聲輔助提取技術(shù)提取的當(dāng)歸藤多糖和黃金茶多糖的ABTS+·清除能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)IC50分別為0.03 mg/mL和0.55 mg/mL，可能由于突隔梅花草多糖與其他活性成分如蛋白質(zhì)，脂類(lèi)等軛合，形成了多糖軛合物[21]，從而ABTS+·清除能力高于當(dāng)歸藤多糖和黃金茶多糖。

3.3.4 ·OH清除能力的測(cè)定

突隔梅花草多糖對(duì)·OH清除能力見(jiàn)圖4d。在2～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，突隔梅花草多糖對(duì)·OH清除能力呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，突隔梅花草多糖對(duì)·OH清除能力達(dá)到95.35%，其IC50為4.15 mg/mL。

曹葉霞等人[22]采用超聲輔助提取技術(shù)提取了黑枸杞多糖，并測(cè)定了提取物對(duì)·OH的清除能力，IC50為6.00 mg/mL，說(shuō)明突隔梅花草多糖具有良好的·OH清除能力，可能由于突隔梅花草多糖碳?xì)滏溕系臍湓虞^多，可以與·OH結(jié)合生成水[21]，從而·OH清除能力較好。

圖4 突隔梅花草多糖的抗氧化活性Fig. 4 Antioxidant ability of P. delavayi polysaccharides注：a.Fe3+還原力；b.DPPH·清除能力；c.ABTS+·清除能力；d.·OH清除能力

4 結(jié)論與討論

本研究從突隔梅花草中提取多糖，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取工藝，得到最佳提取工藝：液料比25 mL/g，超聲時(shí)間54 min；超聲溫度70℃，超聲功率147 W。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到的實(shí)際得率為6.01%。

與蒙古黃芪多糖、灰灰菜多糖相比，突隔梅花草多糖的DPPH·清除效果具有優(yōu)勢(shì)；ABTS+·的清除能力也高于當(dāng)歸藤多糖、黃金茶多糖；同時(shí)也具有優(yōu)于黑枸杞多糖的·OH清除效果。說(shuō)明突隔梅花草多糖具有開(kāi)發(fā)成為保健食品和藥品的潛力。

多糖的抗氧化作用主要與多糖的組成、結(jié)構(gòu)以及分子量等相關(guān)[21]，后續(xù)將對(duì)多糖的組成、結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為突隔梅花草多糖開(kāi)發(fā)成為保健食品和藥品提供理論依據(jù)。