葛 翎，路 露，周 謙，張秋生，蔡 波，黃曉德，張峰倫，錢 雪，李海濤*，陳 斌*，曹 鵬

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023； 2. 南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028； 4. 廣州棟方生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510800；5. 廣州奧蓓斯化妝品有限公司，廣東 廣州 510800)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)，又名馬舌菜、長(zhǎng)命菜，是中國(guó)衛(wèi)生部和世界衛(wèi)生組織指定的天然藥食同源物[1]，常以根莖入藥。馬齒莧對(duì)氣候、土壤等生存環(huán)境條件適應(yīng)性極強(qiáng)，幾乎可以在任何土壤上生存[2]。研究表明其具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]等多種生物學(xué)活性，在臨床上常用于痢疾、腸炎治療。這些功效及活性主要與其含有豐富的黃酮類、多糖類、生物堿類物質(zhì)有關(guān)[6-7]。

目前，馬齒莧資源的利用僅限食用及簡(jiǎn)單藥用，而其實(shí)用價(jià)值研究主要集中在植物培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化[8]、提取工藝改進(jìn)[9]及多糖類和生物堿類成分抗腫瘤、抗氧化機(jī)制研究[10]等方面，而在抗敏、修復(fù)肌膚屏障、降脂、降糖等方面研究較少，并且甚少涉及資源開發(fā)及產(chǎn)品應(yīng)用。同時(shí)，相關(guān)研究表明馬齒莧水提物能夠通過(guò)作用于血管內(nèi)皮的α-受體，抑制毛細(xì)血管通透性，減輕炎癥反應(yīng)，緩解過(guò)敏癥狀，加速上皮細(xì)胞的生理功能恢復(fù)，促進(jìn)潰瘍的修復(fù)、愈合[11-12]，可以作為一種抗敏修復(fù)藥應(yīng)用在皮膚病治療中。動(dòng)物試驗(yàn)[13]表明馬齒莧能夠改善高脂血癥，防止脂質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)馬齒莧醇提物(PortulacaoleraceaL. ethanol extract，POEE)進(jìn)行安全性、生物活性評(píng)價(jià)，以期為其在醫(yī)藥、護(hù)膚品行業(yè)深層次應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐并為該領(lǐng)域提供天然的植物原料。

1 試劑與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

馬齒莧(中國(guó)北京同仁堂有限公司)；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.2 試劑

透明質(zhì)酸酶、酪氨酸酶(Aladdin試劑有限公司)；α-葡萄糖苷酶(上海瑞永生物科技有限公司)；氫氧化鈉、無(wú)水氯化鈣、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；L-左旋多巴(美國(guó)Abcam公司)；透明質(zhì)酸鈉(華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)；對(duì)二甲氨基苯甲醛(上海Macklin科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)儀器

722E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；HZQ-F160型全溫度震蕩培養(yǎng)箱(太倉(cāng)華美生化儀器廠)；DFT-1000型高速萬(wàn)能打粉機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；BSA224S型電子分析天平(北京楚齊儀表有限責(zé)任公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 馬齒莧醇提液制備工藝

用高速粉碎機(jī)將馬齒莧藥材進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，最后將過(guò)完篩的馬齒莧粉末置于干燥器中密封保存，備用。

稱取馬齒莧粉末100 g，料液比1:15(g/mL)，提取溫度為50℃，乙醇濃度為70%，時(shí)間為53 min，后過(guò)濾，濾液旋蒸至一定體積，并干燥至恒重，得到馬齒莧醇提物，按試驗(yàn)所需質(zhì)量濃度配置成一定質(zhì)量體積濃度的醇提取物溶液[14-15]。

2.2 最小抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定

參考王玲等[16]的方法，采用試管倍比稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(Minimal inhibition concentration，MIC)，用二甲亞砜將樣品稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1溶液備用。取1 mL液體培養(yǎng)基、500 μL不同濃度樣品和500 μL菌懸液(1×108CFU/mL)，加入到試管中，充分混勻。試管置于37℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。以含有二甲亞砜的液體培養(yǎng)基和菌液的試管為陰性對(duì)照。觀測(cè)其MIC值，平行試驗(yàn)3次，取平均值。確定MIC后，測(cè)定最小殺菌濃度(Minimal fungicidal concentration，MBC)[17]，將有效抑菌濃度藥液移種、均勻涂布至空白的馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置在37℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基上有無(wú)菌體生長(zhǎng)，以培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)減少原始菌落的99.9%的馬齒莧醇提物的濃度為最小殺菌濃度。平行試驗(yàn)3次，取平均值。

2.3 透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)

對(duì)Elson-Morgan法進(jìn)行改進(jìn)、測(cè)定[18-19]，配置質(zhì)量濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg·mL-1POEE。取0.25 mmol·L-1CaCl2溶液0.1 mL和0.5 mL透明質(zhì)酸酶37℃水浴鍋保溫20 min；取出后每組加入POEE 0.5 mL，繼續(xù)37℃保溫20 min；加入0.5 mL透明質(zhì)酸鈉液37℃水浴鍋保溫40 min，常溫放置10 min；每組加入0.4 mol·L-1NaOH 0.1 mL溶液和0.5 mL乙酰丙酮(現(xiàn)配)溶液，置于沸水浴中加熱15 min后取出，立即用冰水進(jìn)行冷卻15 min；加入埃爾利希試劑1.0 mL，經(jīng)充分振蕩后加入無(wú)水乙醇至8.0 mL，室溫放置20 min顯色，并用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定其吸光值。將撲爾敏作為陽(yáng)性對(duì)照品，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

式中：A為對(duì)照溶液Abs值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液)；B為對(duì)照空白Abs值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液)；C為試樣溶液Abs值；D為試樣空白溶液Abs值(用醋酸緩沖溶液代替酶液)。

2.4 酪氨酸酶抑制率測(cè)試

參考劉曉英等[20]、嚴(yán)航等[21]方法改進(jìn)，取馬齒莧醇提物溶于磷酸鹽緩沖液(pH=7)，稀釋成不同質(zhì)量濃度的POEE，按照表1設(shè)計(jì)向試管中依次分別加入PBS、POEE和酪氨酸酶溶液(100 U/mL)，混合均勻，置于37℃水浴恒溫反應(yīng)10 min，分別迅速加入0.5 mL L-左旋多巴溶液(1.5 mmol/L)，混合均勻，反應(yīng)15 min，在475 nm處測(cè)定吸光值(A)，各反應(yīng)組吸光值分別記作A1、A2、A3和A4，并設(shè)置熊果苷為對(duì)照。按照以下公式計(jì)算馬齒莧樣品液對(duì)酪氨酸酶的抑制率:

表1 各反應(yīng)液組成Table 1 Reaction liquid composition

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)

參考楊曉軍等[22]、姜翠翠等[23]的方法進(jìn)行改動(dòng)，測(cè)定樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。分為樣品組、樣品對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陰性空白對(duì)照組，POEE的濃度分別為20、40、60、80、100、200 mg·mL-1，加入的試劑按表2操作。加入不同濃度POEE與α-葡萄糖苷酶，37℃恒溫孵育15 min，再加入對(duì)硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(P-nitrophenol glucopyranoside,PNPG)(1 mmol·L-1)37℃恒溫繼續(xù)孵育20 min后，最后加入100 μL Na2CO3(1 mol·L-1)終止液終止反應(yīng)。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組重復(fù)3次，同時(shí)以不同濃度阿卡波糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：As為樣品組吸光值；Asc為樣品對(duì)照組吸光值；Ac為陰性對(duì)照組吸光值；Abc為陰性空白對(duì)照組吸光值。

2.6 馬齒莧醇提液安全性評(píng)價(jià)及降脂活性檢測(cè)

2.6.1 馬齒莧醇提液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型

Raw 264.7細(xì)胞活力的影響

參考李秀英等[24]方法，略有改動(dòng)。0～200 μg·mL-1ox-LDL誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性；利用ox-LDL建立動(dòng)脈粥樣硬化Raw 264.7細(xì)胞模型，加入不同濃度的POEE進(jìn)行干預(yù)，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。并設(shè)立正常藥液組(只加入不同濃度POEE)，以觀察不同濃度藥液對(duì)Raw 264.7細(xì)胞的影響。

表2 馬齒莧醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定的加樣表Table 2 Sample of the determination of α-glucosidase inhibitory activity by the POEE (μL)

2.6.2 馬齒莧醇提物對(duì)Raw 264.7細(xì)胞動(dòng)脈粥硬

化模型中胞內(nèi)TC和FC含量的影響

設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、馬齒莧醇提物藥液組。適應(yīng)性培養(yǎng)24 h后，換成無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，適應(yīng)性培養(yǎng)1 h。馬齒莧醇提物藥液組加入不同濃度藥液，使其終濃度分別為400、300、200、100 μg·mL-1(A～D組)，培養(yǎng)4 h后，加入造模所用ox-LDL使其終濃度為60 μg·mL-1。經(jīng)過(guò)24 h孵育，用0.25%含二胺四乙酸胰蛋白酶消化液消化后收集細(xì)胞，按照脂質(zhì)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TC和FC含量。以80 μg·mL-1苯扎貝特為陽(yáng)性對(duì)照組，每組重復(fù)4次。

3 結(jié)果與分析

3.1 最小抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定結(jié)果

POEE對(duì)5種菌的MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3和表4。POEE對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制效果(表3)。POEE濃度為50 mg·mL-1時(shí)，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌不生長(zhǎng)，而金黃色葡萄球菌在濃度為100 mg·mL-1時(shí)不生長(zhǎng)。由表可知POEE對(duì)白色念珠菌抑制效果最佳，其MIC和MBC 值分別為50、100 mg·mL-1, 對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最差，MIC和MBC 值分別為100、100 mg·mL-1。

3.2 馬齒莧醇提物透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，POEE對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率隨著濃度的增大而增大，呈濃度依賴型增長(zhǎng)。30 μg·mL-1陽(yáng)性對(duì)照撲爾敏對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率為80%，10 mg·mL-1POEE可達(dá)到80%，由此可知POEE具有顯著的抗敏活性。

表3 最小抑菌濃度結(jié)果Table 3 Results of minimum inhibitory concentration

表4 馬齒莧醇提物對(duì)5種菌種的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration and minimumbactericidal concentration of the POEE against 5 species of bacteria

圖1 透明質(zhì)酸酶抑制結(jié)果Fig. 1 Hyaluronidase inhibition rates of the POEE

3.3 酪氨酸酶抑制率測(cè)試結(jié)果

由表5可知，在2.5～20 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，POEE和熊果苷對(duì)酪氨酸酶的抑制率成正比。當(dāng)POEE濃度為20 mg·mL-1時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制率高達(dá)76.71%，其抑制率是同等濃度熊果苷的1.25倍。表明馬齒莧可以成為一種有效且對(duì)人體無(wú)毒副作用的天然酪氨酸酶抑制劑。

表5 馬齒莧醇提物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果Table 5 Inhibitory effect of the POEE on tyrosinase

3.4 α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，POEE濃度在20～200 mg·mL-1范圍內(nèi)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈正相關(guān)作用。當(dāng)其濃度為200 mg·mL-1時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)49%，其抑制效果接近于阿卡波糖(200 mg·mL-1)，說(shuō)明馬齒莧具有潛在的降糖功效。

3.5 馬齒莧醇取物改善動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)指標(biāo)

細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與模型組相比，POEE在100～400 μg·mL-1濃度內(nèi)，對(duì)細(xì)胞增殖活力無(wú)顯著影響，具有顯著安全性(p<0.05)。在安全給藥濃度下，300 μg·mL-1POEE能夠最好保護(hù)被60 μg·mL-1ox-LDL損傷細(xì)胞，提高受損傷細(xì)胞增值活力。

圖2 不同樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig. 2 Inhibition of α-glucosidase by different samples

圖3 不同濃度馬齒莧醇提物對(duì)泡沫細(xì)胞增殖活性的影響及安全性評(píng)價(jià)Fig.3 The ratio of the POEE with different concentration to the proliferation activity of foam cells and its safety evaluation注：*P<0.05；***P<0.001；****P<0.000 1，下同

如圖4所示，表明馬POEE能夠降低Raw 264.7細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化模型中胞內(nèi)總膽固醇及游離膽固醇含量，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，其效果與80 μg·mL-1苯扎貝特沒(méi)有顯著差異(P<0.05)。

4 討 論

馬齒莧醇提物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制效果，這與翟興禮[25]的研究結(jié)果相似。抑菌效果證實(shí)與提取物濃度有相關(guān)性，但對(duì)不同菌種有差異性。其中對(duì)白色念珠菌抑制效果最佳，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最差，這可能是由于其醇提物成分抑制真菌能力較強(qiáng)。谷春梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧提取物中黃酮的抑菌順序?yàn)椋航湍妇?黑曲霉>大腸桿菌，這也進(jìn)一步表明馬齒莧提取物對(duì)真菌的抑制效果強(qiáng)于細(xì)菌。

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)TC/FC比較Fig. 4 Comparison of TC/FC in each group

目前，在洗護(hù)用品檢測(cè)中常見(jiàn)的的抗過(guò)敏試驗(yàn)方法有透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)、肥大細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)、被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)和毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)等[27]。其中，透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)是一種與過(guò)敏具有強(qiáng)相關(guān)性的測(cè)定方法。本試驗(yàn)表明POEE對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，這可能是由于醇提物含有黃酮、香豆素、生物堿等非極性物質(zhì)[28]，這些有效成分對(duì)透明質(zhì)酸酶活性有顯著抑制作用。此外，胡一梅[29]的動(dòng)物試驗(yàn)也證實(shí)馬齒莧醇提液對(duì)急性濕疹具有緩解治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制毛細(xì)血管通透性，抑制炎性腫脹，從而減輕濕疹局部的瘙癢、水腫癥狀。由此也驗(yàn)證了馬齒莧提取液具有顯著的抗敏活性。

酪氨酸酶是普遍存在于人體內(nèi)對(duì)黑色素生物合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶，抑制酪氨酸酶活性是目前評(píng)價(jià)植物天然成分美白功效的標(biāo)準(zhǔn)之一[30]。POEE對(duì)酪氨酸酶具有明顯抑制效果，且呈濃度依賴性，具有美白作用，這與張理平等[31]的研究結(jié)果一致。這可能是由于POEE中的酸性成分具有抑制酪氨酸酶活性的作用[32]。其可能作用機(jī)制是通過(guò)與酪氨酸酶的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)多巴的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)黑色素的分解從而有效地抑制皮膚中酪氨酸酶活性，減少皮膚色素沉積。

在降糖功效研究方面，POEE濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈正相關(guān)關(guān)系，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷水解酶。其良好的降糖效果表明可以將其開發(fā)成一種天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑。天然產(chǎn)物中的α-葡萄糖苷酶的抑制會(huì)影響碳水化合物在小腸上部的吸收，降低糖尿病人餐后高血糖水平，預(yù)防因血糖波動(dòng)引發(fā)的心血管疾病等[33]。然而長(zhǎng)期服用會(huì)引發(fā)消化系統(tǒng)紊亂等副作用[34]。因此，需要精確控制產(chǎn)品用量。

血脂過(guò)高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素，大量含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞是初期病變的特征性表現(xiàn)。因此，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，減輕巨噬細(xì)胞泡沫化成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要手段[35-38]。動(dòng)物試驗(yàn)[39]結(jié)果顯示富含不飽和脂肪酸的馬齒莧可降低家兔血清中 TC、TG、LDL-C含量，升高HDL- C含量水平，提高機(jī)體抗自由基作用，減少丙二醛的形成，從而達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化形成、預(yù)防心血管疾病的作用。POEE對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，一方面可能是因?yàn)轳R齒莧含有豐富的ω-3不飽和脂肪酸，其作為一種膽固醇的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)載體，能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)運(yùn)到血管外周組織代謝，防止過(guò)多膽固醇沉積于血管壁內(nèi)，從而緩解動(dòng)脈粥樣硬化[40]。另一方面，馬齒莧含大量抗氧化作用的有效成分，能提高機(jī)體抗自由基作用，減少丙二醛的形成，從而逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化形成、預(yù)防心血管疾病[41]。

5 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)馬齒莧的生物活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明POEE可以作為一種安全無(wú)刺激的天然防腐劑添加到化妝品中，從而降低化學(xué)抑菌劑和防腐劑在護(hù)膚品中的應(yīng)用。同時(shí)，POEE能夠減輕或抑制常見(jiàn)致敏源對(duì)皮膚的刺激作用、增強(qiáng)皮膚的屏障功能，表現(xiàn)了其在美白和抗過(guò)敏方面的功效，可以作為美容產(chǎn)品中美白和抗過(guò)敏作用的原料來(lái)源。另一方面，POEE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用、對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型中泡沫細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞內(nèi)TC、FC的抑制作用，表明馬齒莧在降血糖、降血脂方面具有良好功效，可作為潛在的保健品原料或添加劑。

通過(guò)POEE在抑菌、抗敏、美白、降糖、降脂等方面的試驗(yàn)研究，為馬齒莧在除食用之外作為一種多功效的原料應(yīng)用到更廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。