楊德政 孫光軍 桑維鈞

摘要為獲得能有效抑制煙草赤星病菌的拮抗菌，通過(guò)平板對(duì)峙法，篩選出一株對(duì)煙草赤星病菌有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，通過(guò)形態(tài)、生理生化特征以及16SrRNA、gyrA序列分析等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，Y6菌株對(duì)煙草赤星病菌有較好的抑制作用，其與貝萊斯芽孢桿菌（BacillusvelezensisLF01）的同源性最高，形態(tài)和生理生化特征與貝萊斯芽孢桿菌基本相符。經(jīng)過(guò)測(cè)試，Y6菌株的最佳培養(yǎng)條件：溫度30°C、pH6.0、轉(zhuǎn)速180r/min，碳源選擇葡萄糖，氮源選擇酵母膏。該試驗(yàn)結(jié)果可為貝萊斯芽孢桿菌在生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞煙草赤星病;貝萊斯芽孢桿菌;篩選鑒定;生長(zhǎng)條件

中圖分類號(hào)S435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2021）08-0130-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening，IdentificationandGrowthConditionOptimizationofanAntagonisticBacteriaStrainY6againstTobaccoBrownSpot

YANGDe-zheng1，SUNGuang-jun2，SANGWei-jun1，3（1.CollegeofTobacco，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025;2.GuizhouBranchofChinaTobaccoCorporation，Guiyang，Guizhou550025;3.GuizhouKeyLaboratoryforTobaccoQualityStudy，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025）

AbstractInordertoobtaintheantagonisticbacteriastrainwhichcouldeffectivelyinhibittobaccobrownspotdisease，thebiocontrolbacteriawerescreenedbygrowthinhibitionmethodonmedium.Isolatedstrainswereidentifiedbymorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristics，aswellas16SrRNAandgyrAsequence.Theirgrowthconditionswereoptimizedafterward.TheresultsshowedthatY6strainhadstronginhibitoryeffectonAlternariatabacionmediumplate，andhadthehighesthomologywithBacillusvelezensisstrainLF01.Itsmorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristicswerebasicallyconsistentwiththatofBacillusvelezensis.TheoptimumcultureconditionsofY6wereasfollows：30°C，pH=6.0，180r/min，carbonsourceglucose，nitrogensoureyeastextract.ThetestresultscanprovidevaluablereferenceforthemassproductionprocessofBacillusvelezensis.

KeywordsTobaccobrownspotdisease;Bacillusvelezensis;Screeningandidentification;Growthcondition

煙草赤星病是由鏈格孢菌屬的幾種真菌（Alternariaspp.）引起的一種病害，主要發(fā)生于煙草生長(zhǎng)中后期，是煙草葉片的主要病害之一，具有潛育期短、流行速度快等特點(diǎn)，直接影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。赤星病1892年在美國(guó)首次被報(bào)道，1916年在我國(guó)北京附近發(fā)現(xiàn)后，80年代初我國(guó)各大煙區(qū)都出現(xiàn)了此病，給煙草行業(yè)造成了巨大損失[2]。利用生物防治來(lái)防治煙草赤星病是一種有效且具有較大發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒?，周棱波等[3]從健康煙葉上分離出了對(duì)煙草赤星病病原菌具有較好拮抗作用的短芽孢桿菌B12，其在離體葉片上的防效達(dá)66.7%。馬志遠(yuǎn)等[4]利用平板對(duì)峙法從煙草根際土壤和煙草葉圍上篩選出了一株解淀粉芽孢桿菌，其在煙草赤星病菌上抑菌條帶寬度為14.2mm，在用該菌的活性物質(zhì)粗提物與煙草赤星病病原菌孢子液進(jìn)行抑制試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)粗提物對(duì)病原菌孢子的萌發(fā)抑制率高達(dá)85.6%。筆者從煙草根際土壤中篩選到了一株對(duì)煙草赤星病病原菌有一定拮抗作用的細(xì)菌菌株Y6，通過(guò)16SrRNA、gyrA基因序列、形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析，確定其種類，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為評(píng)價(jià)該菌株是否能成為煙草赤星病生防菌提供參考，同時(shí)豐富了防治赤星病的微生物資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株煙草赤星病病原菌，由貴州大學(xué)煙草學(xué)院桑維鈞教授提供;Y6分離自貴州省遵義市綏陽(yáng)縣浦場(chǎng)鎮(zhèn)有赤星病嚴(yán)重病害發(fā)生的煙田根際土壤中。

1.2培養(yǎng)基及試劑盒馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），用于赤星病菌的生長(zhǎng)培養(yǎng);Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB），用于Y6菌株的分離和培養(yǎng);碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL;氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：優(yōu)化后的碳源5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL。百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒;PCR引物及反應(yīng)試劑，由生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3拮抗菌的分離將采自上述地點(diǎn)的土樣各取一小部分充分混勻，稱取10g，放入盛有90mL無(wú)菌水的250mL三角瓶（有玻璃珠）內(nèi)，放在搖床上充分振蕩（180r/min）靜置后，用移液器吸取1mL土壤懸液加至盛有9mL無(wú)菌水的大試管中混勻，即為10-1稀釋液。同樣方法，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤稀釋液。用移液器取200μL的10-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度的土壤懸液放在LB培養(yǎng)基平板上，用滅過(guò)菌的涂布棒涂勻。28℃培養(yǎng)24h，挑出形態(tài)大小不同的單菌落，用平板劃線法純化，移接在新的LB培養(yǎng)基平面上培養(yǎng)及保存。

1.4拮抗菌的篩選拮抗菌的初步篩選利用平板對(duì)峙法[5]。在PDA培養(yǎng)基中央接入直徑5mm的煙草赤星病菌菌落，在赤星病菌四周20mm處接待測(cè)細(xì)菌，細(xì)菌接種點(diǎn)的位置與赤星病菌相對(duì)呈十字形，在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記各菌株編號(hào)。28℃培養(yǎng)5d后觀察是否出現(xiàn)抑制效果。復(fù)篩采用上述同樣方法，培養(yǎng)5d后觀察抑菌效果。

1.5拮抗菌的鑒定

1.5.1形態(tài)特征和生理生化特征。用平板劃線法將菌種接種于平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，按常規(guī)方法觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、表面、凹凸度、透明程度和菌落及培養(yǎng)基顏色等），并進(jìn)行革蘭氏染色。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第9版）[7]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括碳源利用、葡萄糖氧化發(fā)酵、硝酸鹽還原、甲基紅、V.P試驗(yàn)、淀粉水解反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)測(cè)定、H2S的產(chǎn)生等試驗(yàn)。

1.5.216SrDNA序列分析。采用百泰克細(xì)菌基因組DNA提試劑盒提取，使用細(xì)菌16SrDNA通用引物[8]27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1μL，12.5μL2×PCRMastermix，9.5μLddH2O，1μLDNA模板，共計(jì)25μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃5min，94℃30s，54℃退火30s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST相似序列檢索比對(duì)，將待測(cè)拮抗菌確定到屬。

1.5.3gyrA序列分析。采用前一步提取的DNA，使用gyrA引物[8]gyrA-5P（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）、gyrA-3P（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同“1.5.2”。PCR擴(kuò)增程序：94℃5min，94℃30s，53℃退火30s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行Sanger測(cè)序。從NCBI的GenBank下載芽孢桿菌屬的gyrA序列6條，以鏈球菌（Streptococcus）作為外祖，采用mega7.0軟件進(jìn)行Muscle多序列同源性分析，并通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6種子液的制備將篩選出的拮抗菌接種至LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，30℃、180r/min下培養(yǎng)24h待用。

1.7生長(zhǎng)曲線測(cè)定將液體種子液按1%的接種量接入裝有100mLLB培養(yǎng)液的三角瓶中，在30℃、180r/min下培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，測(cè)定600nm的光密度值（OD600）。

1.8拮抗菌生長(zhǎng)條件優(yōu)化

1.8.1不同溫度對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響。將種子液按照1%的接種量接種于100/250mL的LB培養(yǎng)液（pH7.0）中，分別放置于不同溫度（20、25、30、35、40℃）的恒溫培養(yǎng)箱（180r/min）培養(yǎng)，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，24h后測(cè)定其在波長(zhǎng)600nm下的OD值。

1.8.2不同pH對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響。將滅菌后的LB液按每瓶100mL裝入三角瓶中（250mL），分別將pH調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11。將菌懸液按1%接種量接種于不同pH的培養(yǎng)液中，按上一步試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整恒溫振蕩培養(yǎng)箱溫度，恒溫振蕩培養(yǎng)（180r/min），24h后測(cè)定其在波長(zhǎng)600nm下的OD值，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8.3不同轉(zhuǎn)速對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響。以上述2步的結(jié)果調(diào)整LB培養(yǎng)液的pH及培養(yǎng)箱的溫度，將種子液按照1%的接種量接種于調(diào)制好的pH培養(yǎng)液中，分別放入不同轉(zhuǎn)速150、180、210r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，測(cè)定其在波長(zhǎng)600nm下的OD值，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8.4不同碳源對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響。將不同碳源（麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇）按照10g/mL加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按照上述三步的結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)液pH與振蕩培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速，將菌懸液以1%的接種量分別接種于滅好菌的碳源培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，以不加種子液的碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，24h后測(cè)定其在波長(zhǎng)600nm下的OD值。

1.8.5不同氮源對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響。將不同的碳源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米粉）按照10g/mL加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按照上述三步的結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)液pH、振蕩培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、碳源，將種子液以1%的接種量分別接種于滅好菌的氮源培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，以不加種子液的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，24h后測(cè)定其在波長(zhǎng)600nm下的OD值。

1.9數(shù)據(jù)處理采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)單因素方差分析法的Duncans新負(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），利用MicrosoftExcel2010軟件進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選通過(guò)初篩獲得21株具有拮抗作用的菌株，對(duì)這21株菌進(jìn)行復(fù)篩后，有6株菌對(duì)煙草鏈格孢有一定的抑制作用。其中Y6對(duì)煙草鏈格孢菌的抑制作用明顯，故對(duì)Y6進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2拮抗細(xì)菌種類鑒定

菌株Y6在LB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h后，菌落為乳白色，呈圓形，直徑在0.35～0.55cm，表面有褶皺，中間部分凹陷呈火山狀，邊緣為鋸齒狀，不透明（圖1）。生理生化結(jié)果見表1。

以此菌株的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物長(zhǎng)度約在1000bp，菌株的16SrDNA、gyrA序列經(jīng)測(cè)定，分別為1076和1001bp。

將該16SrDNA序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列與芽孢桿菌屬菌株具有較高的相似率，能夠確定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus.sp），但不能根據(jù)BLAST確定到種。

為了確定Y6的種，首先將Y6菌株的gyrA序列于GenBank中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明，該序列與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）具有非常高的相似性。然后利用從GenBank中下載的7條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果表明Y6菌株與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）的菌株LF01（CP058216）在同一分支上，該分支可信度為90%，與其他幾個(gè)種，如16SrDNA的Blast結(jié)果不能區(qū)分的解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）都有一定距離。

2.3菌株Y6生長(zhǎng)曲線

Y6菌株的生長(zhǎng)曲線見圖3，接入LB培養(yǎng)基10h后該菌株的OD600快速上升，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18～20h為對(duì)數(shù)期末期，OD600達(dá)到最大，20h后菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，OD600基本穩(wěn)定。由此可知，該菌生長(zhǎng)速度較快，接種培養(yǎng)18h后達(dá)到最大。

2.4菌株Y6的生長(zhǎng)條件優(yōu)化

2.4.1不同溫度對(duì)Y6菌株生長(zhǎng)的影響。由圖4可知，溫度在20～35℃時(shí)，Y6菌株的OD600均能達(dá)到2，說(shuō)明長(zhǎng)勢(shì)較好。其中，在溫度30℃時(shí)OD600顯著高于其他溫度，說(shuō)明該溫度最適宜Y6菌株生長(zhǎng)。

2.4.2不同pH對(duì)Y6菌株生長(zhǎng)的影響。由圖5可知，在培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，在參加測(cè)試的pH范圍內(nèi)，在pH5～8時(shí)，Y6菌株可以生長(zhǎng)，OD600均能達(dá)到2，pH為3、4、9、10時(shí)菌株幾乎不能生長(zhǎng)，OD600接近于0，其中，pH6時(shí)生長(zhǎng)最好，增減pH其OD600顯著降低。

2.4.3不同轉(zhuǎn)速對(duì)Y6菌株生長(zhǎng)的影響。由圖6可知，在30℃、pH6的條件下，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為180r/min時(shí)OD600顯著高于150和210r/min，因此，180r/min是最適應(yīng)Y6菌株的培養(yǎng)條件。

2.4.4不同碳源對(duì)Y6菌株生長(zhǎng)的影響。由圖7可知，麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇均能被Y6菌株利用，其中葡萄糖的利用率最高，OD600達(dá)3.04，且顯著高于其他4種，麥芽糖與甘露醇次之，果糖的利用率最低，OD600為1.3，且顯著低于其他。

2.4.5不同氮源對(duì)Y6菌株生長(zhǎng)的影響。由圖8可知，參與測(cè)試的4種氮源，Y6菌株能夠較好地利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏3種，其中酵母膏的利用率最高，OD600達(dá)3.18，且顯著高于其他，牛肉膏次之，基本不能利用玉米粉生長(zhǎng)，OD600接近于0。

3結(jié)論與討論

拮抗細(xì)菌在植物病害的生物防治中起著非常重要的作用。其中芽孢桿菌具有較高的生防潛力，所產(chǎn)生的芽孢有耐熱抗逆的特性，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工和菌種在工業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境中存活，是植物病害生防微生物的重要組成部分[9]。

貝萊斯芽孢桿菌是2005年由Ruiz-Garcia等[10]新命名的芽孢桿菌屬的一個(gè)新種。貝萊斯芽孢桿菌能通過(guò)產(chǎn)生抗菌蛋白[11]、脂肽類抗生素[12]等物質(zhì)來(lái)抑制病菌。研究表明貝萊斯芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病菌[11]、白菜黑斑病菌[13]、香蕉枯萎病菌[14]、西瓜枯萎病菌[15]等有拮抗作用。此外，還發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌能促進(jìn)胡椒、馬鈴薯、蘿卜、南瓜、番茄、蘿卜、芝麻等作物的生長(zhǎng)[16]。

該研究從煙田土壤分離得到對(duì)煙草赤星病有抑菌效果的Y6菌株，根據(jù)形態(tài)和生理生化特征，結(jié)合16SrDNA、gyrA2個(gè)位點(diǎn)序列的比對(duì)確定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。經(jīng)過(guò)測(cè)試，Y6菌株的最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃、pH6、轉(zhuǎn)速180r/min，Y6菌株能利用多種碳源和氮源，其中碳源為葡萄糖、氮源為酵母膏時(shí)生長(zhǎng)最好。碳源利用的結(jié)果與羅楚翔等[17]的研究中碳源蔗糖最優(yōu)，葡萄糖其次的結(jié)果不同，可能是因?yàn)樨惾R斯芽孢桿菌株菌之間的個(gè)體差異造成的。在氮源利用的試驗(yàn)中，Y6菌株在玉米粉為氮源的培養(yǎng)液中幾乎不能生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)榧尤胗衩追酆?，培養(yǎng)液濃度過(guò)高，阻礙了菌株的生長(zhǎng)。

該試驗(yàn)結(jié)果為烤煙赤星病的綠色防控提供了新的選擇，相關(guān)培養(yǎng)條件也是普通生產(chǎn)條件下能達(dá)到的，為該菌株的生產(chǎn)工藝提供了參考數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步研究菌株抑制的作用機(jī)制、活性物質(zhì)的提取及實(shí)際防治效果奠定了基礎(chǔ)。

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