冀玉良，李丹，羅嘉凡

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

長期以來，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一直靠使用化肥和農(nóng)藥以達(dá)到農(nóng)作物快速生長和高產(chǎn)的目的，但是化肥和農(nóng)藥施用容易帶來土壤肥力下降、連作障礙、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等一系列問題[1]。微生物肥料具有環(huán)境友好和低能耗的特點，故研發(fā)微生物肥料以部分替代化肥促進(jìn)植物生長是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要途徑[2-4]。乙烯在植物體內(nèi)的正常生理功能是促進(jìn)植物的成熟和衰老，但植物一生的大部分發(fā)育階段只需要少量的乙烯。作為植物的一種自我保護反應(yīng)[5-7]，植物在生長發(fā)育中遇到干旱、水澇、高鹽、酸堿、重金屬協(xié)迫和機械損傷、病原體入侵等不良環(huán)境因素時會產(chǎn)生過多的所謂“逆境乙烯”，過量乙烯會對植物生長產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致植物生長發(fā)育停滯甚或死亡。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（簡稱為ACC）是植物體內(nèi)生成乙烯的直接前體物質(zhì)，在植物根際土壤中存在具有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌，它能通過將ACC催化分解成α-丁酮酸和胺的方式降低植物在逆境環(huán)境下產(chǎn)生過多的乙烯，從而使植物體內(nèi)乙烯保持在適量的水平，減少過量乙烯對植物生長發(fā)育產(chǎn)生的抑制和影響[8-9]。因此，近年來具有ACC脫氨酶活性的根際促生菌的研究日益受到了國內(nèi)外學(xué)者的重視。根據(jù)目前的研究報道，從一種植物根際分離到的促生菌不僅能促進(jìn)本植物的生長，而且對他種植物也會有促生作用[10-13]，如從豆科植物根際分離的促生細(xì)菌對非豆科植物也具有促生作用[14]。眾所周知，連作障礙是困惑藥用植物桔梗種植生產(chǎn)的一大難題[15-16]，本研究以ACC為唯一氮源，從豆科植物根際土壤中分離篩選出具有ACC脫氨酶活性的菌株，并測定其對桔梗的促生作用，以期為克服桔梗的連作障礙，研發(fā)桔梗的促生菌肥提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤及菌株來源

試驗土壤樣本來自商洛市楊斜鎮(zhèn)大豆種植基地的根際土壤；作為對照用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilus）由商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院實驗中心提供。

1.1.2 植物材料

市售桔梗（Platycodon grandiflorus）種子。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）PAF富集培養(yǎng)基（g·L-1）

酪蛋白水解物10 g，蛋白胨10 g，K2HPO41.5 g，無水MgSO41.5 g，甘油10 mL，pH調(diào)至7.2。

2）DF鹽篩選培養(yǎng)基（g·L-1）

組分 1：H3BO310 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，MnSO4·H2O 11.2 mg，MnO310 mg，CuSO4·5H2O 78.2 mg，分別稱量以上藥品溶解于100 mL無菌水中，-4°C冰箱保存。

組分 2：稱量 FeSO4·7H2O 100 mg 溶于 10 mL無菌水，-4°C冰箱保存。

組分 1與組分 2溶液各取 0.1 mL，與MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2HPO46 g，KH2PO44 g，(NH4)2SO42 g，檸檬酸 2 g，H2O 1 000 mL，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g，混勻后pH調(diào)至7.2保存。

3）ADF加富培養(yǎng)基（g·L-1）

將ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）用超純水溶解，經(jīng)抽濾滅菌后加入到預(yù)先滅菌的且不含(NH4)2SO4的DF鹽培養(yǎng)基中，使添加ACC的終濃度為3.0 mmol·L-1，并調(diào)pH至7.2保存。

4）分離純化培養(yǎng)基（g·L-1）

在ADF加富培養(yǎng)基培養(yǎng)液中加入瓊脂（15～20 g·L-1），調(diào) pH 至 7.2。

5）TSB培養(yǎng)基（g·L-1）

胰蛋白胨 17 g，大豆胨 3 g，NaCl 5 g，葡萄糖 2.5 g，K2HPO42.5 g，pH 調(diào)至 7.1。

1.2 方法

1.2.1 ACC脫氨酶活性菌的富集與分離

稱取1 g大豆根際土壤樣品加入50 mL無菌水，振蕩制成土壤懸液，吸取懸液1 mL加入 50 mL PAF 培養(yǎng)液，在 28 °C，200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)。24 h后吸取1 mL振蕩培養(yǎng)菌懸液重復(fù)轉(zhuǎn)接PAF培養(yǎng)液中。培養(yǎng)好后再吸取菌懸液1 mL轉(zhuǎn)至50 mL DF培養(yǎng)液中，相同條件培養(yǎng)24 h后從中吸取1 mL菌懸液加入50 mL ADF培養(yǎng)液中，在相同條件下培養(yǎng)24 h，用于ACC脫氨酶活性細(xì)菌篩選。ACC脫氨酶活性菌的分離用梯度稀釋法，對ADF培養(yǎng)液中的菌懸液進(jìn)行稀釋，取0.1 mL稀釋菌懸液涂布于ADF固體平板上，28°C下培養(yǎng),待菌落長出后挑取單菌落反復(fù)純化，最后根據(jù)菌落形態(tài)和顏色等挑取不同的單菌落保存于TSB培養(yǎng)基斜面。

1.2.2 ACC脫氨酶活性菌酶活力測定

酶的提取：將分離獲得的菌株在TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，在4℃下離心收集菌體，菌體用不含(NH4)2SO4的DF培養(yǎng)液洗滌離心2次后，懸浮于ADF培養(yǎng)液中,于28℃振蕩培養(yǎng)24 h。誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶后，于4℃離心收集菌體，菌體用Tris-HCl緩沖液（濃度為0.1 mol·L-1，pH 7.6）洗滌離心2次。再懸浮于 600 μL，pH為8.0的 0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液中，接著往其中加入30 μL甲苯，迅速振蕩 30 s使細(xì)胞破碎釋放出脫氨酶。取含甲苯的細(xì)胞提取物 200 μL, 并加入濃度為 0.5 mol·L-1的 ACC 20 μL 混勻。

ACC脫氨酶的活力測定參考宋金秋等[17]的方法。酶活力大小用酶活力單位表示，每分鐘ACC脫氨酶催化生成1 μmol α-丁酮酸的量定義為1個酶活力單位。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Bradford法測定總蛋白含量，ACC脫氨酶比活力計算公式為:

1.2.3 ACC脫氨酶活性菌對桔梗的促生試驗

平皿促生試驗參照黃蓋等[18]的方法，挑取大小一致、飽滿均勻、健康無病害的桔梗種子按以下步驟進(jìn)行消毒處理：浸于70%酒精中5 min，然后10%的雙氧水表面消毒5 min，最后無菌水洗5～6次[8-9]。同時將分離到的ACC脫氨酶活力高的菌株P(guān)G41、對照菌株枯草芽孢桿菌分別接種于TSB培養(yǎng)液中，于28℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，4℃離心收集菌體,菌體用無菌水洗滌離心2次后懸浮于無菌水中，在600 nm處將菌懸液光密度調(diào)整為0.5±0.02，即為接種菌懸液。

接種按以下兩種方法進(jìn)行。1）菌液培養(yǎng)接種：在培養(yǎng)皿底平鋪一層滅菌的濾紙，分別用配好的7 mL分離菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、無菌水將濾紙浸濕，再將消毒處理洗凈后的種子置于濕潤的濾紙上。2）菌液浸種接種：將消毒后的種子分別浸于無菌水、枯草芽孢桿菌菌懸液和分離菌菌懸液中浸種過夜，然后再將處理的種子置于放有濾紙（用無菌水濕潤）的培養(yǎng)皿中。接種后的培養(yǎng)皿上部用膜密封，置28℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，待7d后分別測定各培養(yǎng)皿中種子發(fā)芽生長后的根和下胚軸長度。每皿放30粒種子,每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 ACC脫氨酶活性菌的初步鑒定

對分離的ACC脫氨酶活性最大的菌株P(guān)G41在LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌株的形態(tài)、測定其大小，進(jìn)行革蘭氏染色，了解其培養(yǎng)特征；另外測定菌株分解利用糖類、氨基酸、無機鹽以及抗酸抗堿抗鹽能力和生長溫度范圍，了解ACC脫氨酶菌株的生理生化特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACC脫氨酶活性菌的篩選及其酶活性檢測

含有甘油的PAF培養(yǎng)基是選擇性培養(yǎng)基，它有利于細(xì)菌的富集，而對真菌和放線菌的生長有抑制作用；DF是一種基本培養(yǎng)基，以(NH4)2SO4（2.0 g·L-1）為氮源；ADF也是基本培養(yǎng)基，它以ACC代替了 (NH4)2SO4作為唯一的氮源。通過從PAF到DF和ADF培養(yǎng)基的依次定向富集篩選。依據(jù)菌落的形態(tài)、大小和顏色等特征的區(qū)別，本研究從大豆根際土壤中共分離到69株能在以ACC為唯一氮源的ADF培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌菌株，其中8株具有較高的酶活力，編號分別為PG41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83。從測定的酶活力（圖 1）可以看出，這8株菌的ACC脫氨酶比活力有比較大的差異，其中PG41的ACC脫氨酶活性最高,為0.2871U·mg-1，PG74 酶活最小，為 0.132 4 U·mg-1，而作為對照的枯草芽孢桿菌ACC脫氨酶比活力只有 0.023 1 U·mg-1。

圖1 分離的8株菌的ACC脫氨酶比活力

2.2 ACC脫氨酶活性菌酶對桔梗幼苗的促生作用

測定促生試驗每個處理中桔梗幼苗的根和下胚軸長度，并對數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和Z檢驗，統(tǒng)計分析結(jié)果見表1和表2。表1表明，在用菌液培養(yǎng)法接種的條件下，同CK相比，大豆根際ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83均能促進(jìn)桔梗種子幼苗根和下胚軸伸長，其中PG41的促生作用最強，PG25次之，其促進(jìn)根相對伸長率分別為139.80%、136.64%，促進(jìn)下胚軸相對伸長率分別為134.54%、129.29%，根和下胚軸的相對伸長都達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01），菌株P(guān)G37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83 的促生作用也都達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而枯草芽孢桿菌接種時根和下胚軸的相對伸長率分別為94.50%和95.34%，表現(xiàn)出抑制作用。

表1 ACC脫氨酶活性菌液培養(yǎng)接種法對桔梗生長的影響

表2 ACC脫氨酶活性菌浸種接種法對桔梗生長的影響

表2表明，在用浸種法接種的條件下，同CK相比，大豆根際ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83 均能促進(jìn)桔梗種子根和下胚軸伸長，其中PG41和PG25促進(jìn)根相對伸長率分別為138.62%和135.944%,促進(jìn)下胚軸相對伸長率分別為137.01%和132.84，根和下胚軸的相對伸長也都達(dá)到了極顯著的水平（P ＜0.01），菌株P(guān)G37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83的促生作用也都達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而枯草芽孢桿菌則表現(xiàn)出了抑制作用。

對照促生作用測定和各促生菌株ACC脫氨酶活力測定的結(jié)果，可以明顯看出，ACC脫氨酶活性高的菌株對桔梗的促生作用也比較顯著，這也證明ACC脫氨酶活性菌株的促生作用和該酶可能相關(guān)。

從表1和表2中還可以發(fā)現(xiàn)，ACC脫氨酶活性菌株對桔梗的促生作用，在菌液培養(yǎng)接種法和浸種接種法兩種處理方法中表現(xiàn)一致，并無顯著差異，這表明不同的接種方式影響ACC脫氨酶活性菌株對植物的促生作用差異不大，因為不管那一種方式都能使菌株附著于種子表面，所以就能發(fā)揮促生作用。

2.3 ACC脫氨酶活性菌的形態(tài)特征與生理生化特征

2.3.1 菌株P(guān)G41形態(tài)特征觀察

選促生作用最強的ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41在LB平板上培養(yǎng)，觀察得菌落形態(tài)為圓形并隆起，邊緣整齊，菌落表面光滑、濕潤、透明，顏色為淡黃色；革蘭氏染色結(jié)果為陰性細(xì)菌，菌體呈桿狀（圖 2）；測得菌體大小為（0.6～0.9）μm×（1.4～3.1）μm。豆科植物的根瘤菌一般是短桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌，由此推測侵入豆科植物根瘤中的根瘤菌很可能也是其根際土壤中具ACC脫氨酶活性的細(xì)菌。

圖2 ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41的革蘭氏染色

2.3.2 ACC脫氨酶活性菌株的生理生化特性

對ACC脫氨酶活性最高的菌株P(guān)G41進(jìn)行生理生化特性測定（表3），結(jié)果顯示，PG41菌株具有運動性，能夠利用D-葡萄糖、D-乳糖、D-蔗糖、D-甘露醇、肌糖等各種糖類；能夠產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶、過氧化氫酶（接觸酶）、氧化酶、纖維素和淀粉水解酶；在離子型表面活性劑吐溫-20和吐溫-80存在下能夠穩(wěn)定存活；能夠在pH為4～13的條件下生長，生長的溫度范圍為10℃～45℃，耐NaCl的濃度為2%～10%?？傊?，大多數(shù)生化指標(biāo)為陽性，表明ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41具有較強的適應(yīng)能力，能夠在酸、堿和鹽以及干旱土壤中存在，這為其作為根際促生菌的應(yīng)用提供了有利條件。

表3 ACC脫氨酶活性菌株P(guān)G41的生理生化特征

3 討論與結(jié)論

本研究從大豆根際土壤中分離篩選到8株ACC脫氨酶活性較高的細(xì)菌，測得其中PG41和PG25菌株的ACC脫氨酶比活力分別為0.287 1 U·mg-1和 0.251 2 U·mg-1，其比活力明顯大于黃蓋等[18]從草莓根際土壤中分離得到的菌株 ACC30（ACC 脫氨酶比活力為 0.217 U·mg-1），而比魏素娜等[19]從旱地小麥根際土壤中分離得到的變形斑沙雷氏菌CS（ACC脫氨酶比活力為0.016 7 U·mg-1）和霍氏腸桿菌 AS（ACC 脫氨酶比活力為0.018 6 U·mg-1）的ACC脫氨酶比活力大出了一個數(shù)量級。促生作用試驗發(fā)現(xiàn)，篩選的8株菌對桔梗的促生作用明顯，PG41和PG25菌株對桔梗的促生作用達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。通過測定酶比活力和促生作用最大的菌株P(guān)G41的生理生化特征表明，該菌株能利用的糖多、生存溫度以及耐鹽濃度和耐酸堿度范圍都比較寬泛，具有較強的適應(yīng)能力，這些可能都與其能夠較好地在各種土壤環(huán)境生存和促生作用有關(guān)。

植物根際促生菌是寄生于植物根際能夠促進(jìn)植物生長的有益細(xì)菌、放線菌和真菌，它們通過分泌生長素、通過分解土壤中的難溶解物質(zhì)為植物生長提供營養(yǎng)以及對植物病原菌發(fā)生拮抗作用等機制促進(jìn)植物的生長[20-24]。自ACC脫氨酶活性菌發(fā)現(xiàn)以來，目前已經(jīng)從小麥、玉米、油菜、紫花苜蓿、草木犀、水稻等許多植物根際相繼分離出了許多具有ACC脫氨酶活性的促生菌[25-27]。同時發(fā)現(xiàn)從小麥、草莓、油菜等根際土壤中分離到的促生菌對豆科植物紫花苜蓿等的生長也有促生作用的研究報道[18-19]，近年來，還有不少從豆科植物根部分離到的促生菌對非豆科植物的生長有促生作用的研究報道[15-16]?？梢姶偕饔玫臋C制和本質(zhì)在不同植物間可能有共同相通之處。對于具ACC脫氨酶活性的促生菌，目前大量的研究都認(rèn)為它們是通過分解ACC、調(diào)節(jié)控制植物體內(nèi)的乙烯水平而促進(jìn)植物生長的[28-30]。本研究測定結(jié)果也表明，促生菌株對桔梗的促生作用和ACC脫氨酶比活力成正相關(guān)。本研究從大豆根際土壤中分離得到了ACC脫氨酶活性更高的細(xì)菌，拓寬了ACC脫氨酶活性菌的來源和人們對ACC脫氨酶活性菌株生物學(xué)特性的認(rèn)識。

目前普遍認(rèn)為，豆科植物根瘤菌有兩種存在形式，一種是在根瘤內(nèi)的共生存在形式，一種是在土壤中的游離存在形式，而且不僅土壤中的細(xì)菌可以侵入根瘤內(nèi)形成根瘤菌，根瘤內(nèi)的內(nèi)生菌也可以進(jìn)入到土壤中。趙龍飛等[30]從大豆根瘤內(nèi)生菌中篩選出了具ACC脫氨酶活性的內(nèi)生菌，對活性菌株的抗鹽堿性、系統(tǒng)分類地位以及代表菌株的促生作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)所分離的具ACC脫氨酶活性的內(nèi)生菌對小麥的幼苗有明顯的促生作用。本研究從大豆根際土壤中分離到具ACC脫氨酶活性的細(xì)菌，測得對桔梗具有明顯的促生作用。關(guān)于大豆根瘤內(nèi)和根際土壤中存在的ACC脫氨酶活性細(xì)菌是否為同一種屬或同一株型菌株，值得進(jìn)一步通過對菌株的16S rRNA基因序列同源性分析進(jìn)行鑒定[31-32]。如果能找到同源性，將進(jìn)一步證實根瘤菌和土壤根際細(xì)菌的關(guān)系，這對研究微生物的起源和系統(tǒng)進(jìn)化具有重要意義。另外，還應(yīng)進(jìn)一步研究分離的活性菌株對桔梗的大田促生作用，開發(fā)桔梗的微生物促生菌劑。