劉建新 柳 陽(yáng) 彭萬(wàn)宏

超聲、CT、MRI、光聲成像等各種醫(yī)學(xué)影像技術(shù)在檢查敏感性、分辨率等方面各具優(yōu)缺點(diǎn)［1］。目前各種醫(yī)學(xué)影像技術(shù)均有其各自的影像造影劑。盡管各種造影劑對(duì)疾病的診療發(fā)揮了一定的作用，但仍然不能突破單一影像技術(shù)的局限性。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的不斷發(fā)展，尋求多模態(tài)多功能影像造影劑從而實(shí)現(xiàn)多種醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高影像診療的精準(zhǔn)度，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)以葉酸修飾的磷脂和膽固醇的混合物為成膜材料，將超順磁性氧化鐵（Fe3O4）納米顆粒和羥基喜樹(shù)堿（HCPT）裝載于殼層中，液態(tài)氟碳全氟戊烷（PFP）包裹于殼層內(nèi)，制備葉酸靶向相變型載羥基喜樹(shù)堿的納米粒（FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs），并檢測(cè)其各種理化特性及其增強(qiáng)超聲、光聲、MRI 的顯影能力，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.主要試劑和細(xì)胞：氫化大豆卵磷脂、偶聯(lián)葉酸的磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油（美國(guó)Avanti 公司），膽固醇［生工生物工程（上海）股份有限公司］，HCPT（遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司），油酸氧化鐵納米顆粒（OA-Fe3O4，美國(guó) Ocean Nano Tech 公司），PFP（美國(guó)Sigma 公司）；SKOV3 腫瘤細(xì)胞（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）

2.主要實(shí)驗(yàn)儀器：RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），VX130 聲振儀（美國(guó)Heat System 公司），5840R 低溫離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），IX53 光學(xué)顯微鏡（上海賽默飛世爾科技有限公司），S-3400N 電子顯微鏡（日立公司），低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所），MyLab 90 彩色多普勒超聲診斷儀（意大利百勝醫(yī)療集團(tuán)），Achieva 3.0T磁共振儀（荷蘭Philips公司）。

二、納米粒的制備

將氫化大豆卵磷脂、偶聯(lián)葉酸的磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油、膽固醇及HCPT 以一定的質(zhì)量比（10∶4∶3∶3∶2）稱取后加入圓底燒瓶，同時(shí)加入OA-Fe3O4，用甲醇和三氯甲烷加熱溶解。約20 min 后將上述圓底燒瓶固定于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上去除有機(jī)溶劑（時(shí)間120 min），然后加入PBS 洗脫水化，全程冰浴條件下逐滴加入液態(tài)氟碳PFP 200 μl，并使用聲振儀乳化，得到均勻的乳白色混懸液。應(yīng)用低溫離心機(jī)在4℃條件下離心洗滌3 次，所得即為FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用非偶?lián)葉酸的磷脂替代偶聯(lián)葉酸的磷脂即制備成非靶向納米粒，不加入OA-Fe3O4則制備成不含F(xiàn)e3O4的納米粒。

三、納米?；拘阅軝z測(cè)

1.基本性能檢測(cè)：在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察納米粒的形態(tài)。于不同時(shí)間點(diǎn)（制備后6、12、18、24、30、36、42、48 h）分別取樣檢測(cè)FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs的粒徑。加入三氯甲烷和甲醇進(jìn)行破球和溶解藥物，離心分離取上清液，使用反相高效液相色譜法檢測(cè)其內(nèi)HCPT含量。

2.熱致相變研究：取制備好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液稀釋100 倍后滴加于玻片上，并置于加熱板內(nèi)，調(diào)節(jié)溫度分別為40℃、45℃、50℃和55℃，于光學(xué)顯微鏡下觀察納米粒的熱致相變情況并記錄。

四、體外尋靶實(shí)驗(yàn)及分組

將富含葉酸受體的SKOV3 腫瘤細(xì)胞種植在共聚焦專用培養(yǎng)皿內(nèi)，與紅色熒光染料DiI 標(biāo)記的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs（靶向組）和不帶葉酸的非靶向納米粒（非靶向組）共孵育40 min，然后用PBS沖洗，加入多聚甲醛固定腫瘤細(xì)胞。隨后依次加入熒光染料DiO 和DAPI，并避光送檢。拮抗組采用游離葉酸與培養(yǎng)皿內(nèi)SKOV3 細(xì)胞共孵育，然后加入熒光標(biāo)記的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs，并依次進(jìn)行固定、染色。于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組染色情況。

五、體外多模態(tài)顯像增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)及分組

1.增強(qiáng)超聲成像：取2 ml FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液置入凝膠模型，使用LIFU 儀探頭對(duì)凝膠模型內(nèi)乳液進(jìn)行輻照。設(shè)置輻照參數(shù)：脈沖模式，輻照強(qiáng)度3.2 W/cm2，輻照時(shí)間1 min。然后取少許納米粒乳液于光學(xué)顯微鏡下觀察納米粒粒徑變化，了解其相變情況。最后使用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率12 MHz，機(jī)械指數(shù)0.06）對(duì)凝膠模型內(nèi)納米粒乳液進(jìn)行超聲顯像，使用灰階模式和造影模式觀察其在輻照前后超聲顯影情況，并應(yīng)用重慶醫(yī)科大學(xué)DFY 軟件測(cè)量其聲強(qiáng)。

2.增強(qiáng)光聲成像：采用凝膠溶液稀釋制備的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液，按最終混合液內(nèi)Fe3O4濃度將其分為3組：0.5 mg/ml組、1.0 mg/ml組和2.0 mg/ml組，分別制作成凝膠塊并標(biāo)記，以不加納米粒乳液的凝膠作為對(duì)照組，分別行光聲成像并記錄光聲值。光聲儀激光激發(fā)波長(zhǎng)為680～950 nm，激發(fā)深度約1 cm。

3.增強(qiáng)MRI：取脫氣水作為對(duì)照組Ⅰ（Ⅰ），不含納米粒的1%凝膠作為對(duì)照組Ⅱ（Ⅱ）。將FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液用1%凝膠稀釋成不同的濃度作為實(shí)驗(yàn)組，記為：Ⅲ（5 μg/ml）、Ⅳ（10 μg/ml）、Ⅴ（20μg/ml）、Ⅵ（40μg/ml）、Ⅶ（80μg/ml）、Ⅷ（160μg/ml）、Ⅸ（320 μg/ml）、Ⅹ（640 μg/ml）、Ⅺ（1280 μg/ml）、Ⅻ（2560 μg/ml）。使用荷蘭Philips 公司磁共振儀，采用T2 加權(quán)系列，設(shè)置掃描參數(shù)：TR 30.2 ms，TE 9.2 ms，flip 45°，F(xiàn)OV 160 mm，slice thickness 3.0 mm。測(cè)量每組磁共振信號(hào)強(qiáng)度，測(cè)量3次取平均值。

結(jié) 果

一、納米?；拘阅軝z測(cè)

不含F(xiàn)e3O4的納米粒乳液外觀呈乳白色，含F(xiàn)e3O4的納米粒乳液呈黑褐色（圖1A）。光學(xué)顯微鏡下制備好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 呈球形，大小均一，分布均勻（圖1B）；激光共聚焦顯微鏡下納米粒呈球形或點(diǎn)狀（圖1C）。馬爾文儀測(cè)得納米粒平均粒徑約（321.20±67.21）nm，電位約-50 mV。透射電鏡顯示Fe3O4顆粒在納米粒內(nèi)呈黑色小顆粒狀（圖1D），而不含F(xiàn)e3O4顆粒的納米粒內(nèi)未見(jiàn)黑色小顆粒（圖1E）。高效液相色譜法測(cè)得藥物包封率和載藥量分別為（60.51±2.33）%、（8.33±0.57）%。儲(chǔ)存在4℃冰箱內(nèi)的納米粒在48 h 內(nèi)呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，其粒徑大小變化見(jiàn)圖1F。

二、納米粒熱致相變結(jié)果

在40℃時(shí)，無(wú)氣泡產(chǎn)生；45℃時(shí)鏡下可見(jiàn)氣泡，已發(fā)生相變；50℃時(shí)，可見(jiàn)大量氣泡產(chǎn)生；55℃時(shí)鏡下僅可見(jiàn)少許殘留大氣泡。見(jiàn)圖2。

三、體外尋靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在激光共聚焦顯微鏡下，經(jīng)熒光染料DAPI 染色后的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，經(jīng)DiO 染色后的細(xì)胞膜呈綠色熒光，經(jīng)DiI 染色后的納米粒呈紅色熒光。靶向組鏡下可見(jiàn)較多紅色熒光聚集在細(xì)胞膜周圍，而在非靶向組和拮抗組的細(xì)胞膜周圍未見(jiàn)明顯紅色熒光聚集。見(jiàn)圖3。

四、體外多模態(tài)顯像增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 基本性能檢測(cè)

圖2 不同溫度下納米粒的熱致相變光學(xué)顯微鏡圖

本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的納米粒乳液進(jìn)行體外光聲及MRI。①納米粒乳液經(jīng)LIFU 輻照后，灰階超聲顯示其回聲增強(qiáng)，輻照前后聲強(qiáng)分別為（12.2±2.8）dB、（136.5±5.7）dB，超聲造影模式下顯示其高增強(qiáng)；輻照前后聲強(qiáng)分別為（6.7±2.3）dB、（86.3±5.2）dB；光鏡下可見(jiàn)輻照后納米粒體積增大，見(jiàn)圖4。②隨著濃度的增加，納米粒體外增強(qiáng)光聲成像的效果漸趨明顯（圖5），對(duì)照組、0.5 mg/ml組、1.0 mg/ml 組和 2.0 mg/ml 組所對(duì)應(yīng)的光聲值分別為0.21±0.09、0.58±0.06、1.41±0.12、2.13±0.11。③隨著濃度的增加，納米粒體外負(fù)性增強(qiáng)MRI的效果越明顯，見(jiàn)圖6。

圖3 體外尋靶實(shí)驗(yàn)的激光共聚焦顯微鏡圖

圖4 納米粒體外增強(qiáng)超聲成像圖

圖5 不同濃度組納米粒體外增強(qiáng)光聲成像圖

圖6 納米粒體外增強(qiáng)MRI圖

討 論

傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查方式均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)［3］，融合多種成像模式的多功能造影劑的出現(xiàn)為現(xiàn)代分子影像學(xué)的發(fā)展指明了方向［4］，除顯像功能外，其還能夠在造影劑上裝載藥物，在影像監(jiān)控下實(shí)現(xiàn)靶向治療。在這一思路引導(dǎo)下，本實(shí)驗(yàn)擬制備集增強(qiáng)超聲、光聲、MRI及藥物控釋功能于一體的多模態(tài)多功能造影劑，并檢測(cè)其理化特性，驗(yàn)證其增強(qiáng)多模態(tài)顯像效能。

Shin 等［5］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然液態(tài)氟碳 PFP 沸點(diǎn)僅29℃，但經(jīng)磷脂包裹成為納米級(jí)顆粒后，由于納米粒周圍的Laplace 壓力明顯增加，PFP 的氣化閾值隨之升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在40°C 時(shí)納米?；静话l(fā)生相變，當(dāng)溫度逐漸升高至50°C 時(shí)，納米粒相變最顯著，鏡下見(jiàn)相變后產(chǎn)生大量氣泡，這說(shuō)明PFP 納米粒既能保持一定的穩(wěn)定性，也能在一定條件下繼發(fā)相變。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)制備的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 在4℃條件下可穩(wěn)定保存48 h 而不發(fā)生明顯相變。反相高效液相色譜法測(cè)得的HCPT 載藥量（8.33±0.57）%，包封率（60.51±2.33）%，較高的包封率和載藥量為后續(xù)的治療研究提供了保障。

本實(shí)驗(yàn)使用的磷脂成分與生物有機(jī)體細(xì)胞膜的磷脂成分相同，安全性高；液態(tài)氟碳具備較好的攜氧能力，可被用作血液替代品［6］，同時(shí)其還能夠溶解于血液中并通過(guò)呼氣排出體外［7］；Fe3O4在體內(nèi)可被紅細(xì)胞代謝，再進(jìn)入正常血漿鐵池，參與到機(jī)體的代謝過(guò)程，具備良好的生物安全性［8］。葉酸性質(zhì)穩(wěn)定，分子量小，且無(wú)免疫原性［9］，較多惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌等組織中葉酸受體均呈高表達(dá)，而在正常組織中葉酸受體不表達(dá)［10］。在體外尋靶實(shí)驗(yàn)中，靶向組在SKOV3腫瘤細(xì)胞周圍及內(nèi)部見(jiàn)較多納米粒聚集，而非靶向組SKOV3 腫瘤細(xì)胞周圍及內(nèi)部無(wú)納米粒聚集，說(shuō)明葉酸具備的高效靶向性有連接其受體的能力；拮抗組在加入游離葉酸后，阻斷了后續(xù)加入的靶向納米粒與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合，也從側(cè)面說(shuō)明了葉酸與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的高效特異性。

體外多模態(tài)顯像增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)A-HCPTFe3O4-PFP NDs 可以明顯增強(qiáng)超聲、光聲及MRI 顯影能力。液態(tài)氟碳PFP具備良好的熱致相變及聲致相變的特性，超聲波被認(rèn)為是最有效的繼發(fā)相變的方式，本研究中使用LIFU儀輻照制備的納米粒乳液，使得納米粒發(fā)生聲致相變，從而明顯增強(qiáng)超聲成像效果。引入Fe3O4后，納米粒具備增強(qiáng)光聲成像的作用，且隨著納米粒濃度的增加，光聲信號(hào)明顯增強(qiáng)，光聲值亦明顯升高。作為一種負(fù)性增強(qiáng)對(duì)比劑，F(xiàn)e3O4使得納米粒的MRI T2 信號(hào)強(qiáng)度降低，且濃度越高其信號(hào)強(qiáng)度越低，與對(duì)照組的高信號(hào)呈明顯差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 同時(shí)裝載了PFP 和Fe3O4，有望實(shí)現(xiàn)多模態(tài)顯像；引入HCPT，使其在多模態(tài)顯像的同時(shí)，能夠達(dá)到藥物治療的目的；在納米粒表面修飾葉酸受體后，納米粒能夠特異性的靶向結(jié)合于高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞周圍，進(jìn)行局部精準(zhǔn)顯像和靶向治療，使得FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs有望成為極具潛力的分子探針。