陳邦銀 黃 津

福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院感染科，福建省南平市 353000

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)仍是一類危害人類健康的慢性傳染病，據(jù)統(tǒng)計可達(dá)上百萬人次死于因HBV感染相關(guān)性疾病，尤其在我國發(fā)病率和住院率均較高，目前尚無可以徹底治愈CHB的藥物[1]。肝病研究學(xué)者們對乙型肝炎(乙肝)的發(fā)病機(jī)制仍在不斷的探索，至今仍有許多疑問亟待解決，認(rèn)為HBV感染的發(fā)病機(jī)制與CHB患者的年齡、病毒載量、機(jī)體免疫以及傳播途徑等因素有關(guān)[2]。

NF-κB屬于重要的轉(zhuǎn)錄因子，尤其是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，介導(dǎo)多種炎癥傳導(dǎo)途徑的特異性反應(yīng)，可調(diào)控機(jī)體中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫反應(yīng)，發(fā)揮著較強(qiáng)的橋接和承上啟下的功能[3]。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)作為NF-κB下游的關(guān)鍵信號結(jié)合因子，參與各種炎癥因子的致病過程，可介導(dǎo)各種免疫細(xì)胞反應(yīng)，比如氧化應(yīng)激、抗原抗體反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，在病毒性肝炎中可分泌大量致炎因子一氧化氮[4]。因此，本文通過研究CHB患者外周血中NF-κB、iNOS的表達(dá)水平，了解其致炎過程，進(jìn)一步發(fā)掘潛在的免疫治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入南平市第一醫(yī)院感染性疾病科在2017年4月10日—2020年4月10日收治的80例CHB患者作為肝炎組，所研究對象肝功能要求谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≥400U/L，男44例，女36例，年齡19～66歲,平均年齡(47.5±11.2)歲；從我院體檢中心選取60例健康人群作為對照組，男33例，女27例，年齡18～59歲，平均年齡(47.3±9.3)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均簽署知情同意。入選標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg陽性>6個月，且HBV DNA持續(xù)陽性，ALT≥400U/L[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他類型的病毒性肝炎、藥物性肝炎、重型肝炎、中晚期肝硬化、肝細(xì)胞癌、自身免疫性肝病等；同時排除合并妊娠、心血管系統(tǒng)疾病、血液病、重癥感染性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤等。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑：冷凍離心機(jī)(Eppendor公司，德國)；凝膠成像系統(tǒng)(Eppendor公司，德國)；Bandscan5.0圖像分析軟件(Bio-Rad公司，美國)；酶標(biāo)儀(Labststems公司，芬蘭)；超低溫冰箱(三洋公司，日本)；Trizol裂解液(Invitrogen公司，美國)；一氧化氮ELISA試劑盒(BD公司，美國)；人NF-κB p65抗體和人iNOS抗體(Bio-Rad公司，美國)。

1.2.2 RT-PCR檢測NF-κB mRNA和iNOS mRNA表達(dá)：兩組標(biāo)本均取外周血液6ml，分離出血漿(離心半徑10cm，1 500r/min，離心5min)，將血清吸出制成細(xì)胞懸液，往細(xì)胞懸液中加Trizol裂解液200μl進(jìn)行裂解，嚴(yán)格根據(jù)說明書步驟提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)GenBank給出的序列設(shè)計引物，詳見表1。

表1 NF-κB、iNOS和β-actin引物序列

1.2.3 Western Blot方法檢測NF-κB和iNOS蛋白的表達(dá)：采集清晨空腹靜脈血5ml，將外周血配成細(xì)胞混懸液，加入裂解液，通過高速離心獲得蛋白、檢測蛋白濃度，取20μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。在室溫下用50g/L牛血清白蛋白封閉液進(jìn)行封閉2h，洗膜后加NF-κB、iNOS、GAPDH一抗孵育，4℃封閉過夜，加入二抗孵育2h，最后曝光、顯影、定影，結(jié)果用NF-κB/GAPDH、iNOS/GAPDH比值表示(Bandscan5.0軟件分析)。

1.2.4 ELISA檢測NO水平：嚴(yán)格依據(jù)NO檢測試劑盒操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以各組OD值表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組NF-κB mRNA和iNOS mRNA表達(dá)水平 所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，并計算兩組相對表達(dá)量，肝炎組NF-κB mRNA和iNOS mRNA的表達(dá)水平均高于對照組，二者具有顯著性差異(均P<0.01)，詳見表2。

表2 兩組NF-κB mRNA和iNOS mRNA表達(dá)情況

2.2 兩組NF-κB和iNOS蛋白表達(dá)水平 肝炎組NF-κB和iNOS蛋白表達(dá)水平均高于對照組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，詳見表3、圖1。

表3 兩組NF-κB和iNOS蛋白的表達(dá)情況

圖1 NF-κB、iNOS和GAPDH蛋白表達(dá)情況

2.3 兩組NO水平的比較 肝炎組的NO水平為(112.51±20.73)μmol/L，明顯高于對照組的(65.18±14.54)μmol/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.34，P=0.001<0.05)。

3 討論

大多數(shù)HBV感染者可以通過機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)將病毒完全清除，仍有部分HBV感染者因免疫功能紊亂，最終演變成慢性HBV病毒感染，如果不注意誘因的控制，隨時有可能激發(fā)乙肝病毒復(fù)制[5]。研究表明[6]，慢性乙型肝炎具有一定個體差異，每個感染者的免疫狀態(tài)、病毒活躍指數(shù)、肝細(xì)胞的炎癥程度都不完全一致，在機(jī)體免疫應(yīng)答具有一定調(diào)控作用。本研究通過以慢性乙型肝炎患者作為研究對象，通過基因檢測和蛋白檢測手段分析NF-κB、iNOS、NO在乙肝患者中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝炎患者的上述指標(biāo)明顯高于健康對照組人群，提示NF-κB、iNOS、NO等炎癥因子可能參與慢性乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程，有望通過干預(yù)NF-κB、iNOS、NO等細(xì)胞因子控制炎癥反應(yīng)。

NF-κB經(jīng)過很多學(xué)者證實，屬于一種重要細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種細(xì)胞的炎癥信號傳導(dǎo)通路，由于其具有多向性調(diào)節(jié)功能，起著關(guān)鍵的橋接作用[7]。NF-κB對體液免疫和細(xì)胞免疫亦具有顯著作用，可以通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞Ig基因的表達(dá)，同時T細(xì)胞的增殖活化也很關(guān)鍵，可促使下游iNOS增多，分泌大量的一氧化氮，可造成細(xì)胞和組織損傷[8]。王翔鵬等[9]學(xué)者通過建立小鼠肝損傷模型，采用刀豆蛋白A干預(yù)肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)隨著刺激誘導(dǎo)時間的延長，NF-κB轉(zhuǎn)入核內(nèi)水平持續(xù)上升，小鼠肝組織內(nèi)生成超過生理劑量并具有細(xì)胞毒性的NO，加重肝組織免疫損傷。還有研究報道[10]，通過建立免疫性損傷小鼠模型，使用NF-κB抑制劑后可下調(diào)iNOS的表達(dá)，減少NO的分泌，最終減輕小鼠免疫性肝損傷，由此認(rèn)為NF-κB調(diào)控iNOS、NO可能是出現(xiàn)肝臟免疫性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究發(fā)現(xiàn)二者在肝炎組表達(dá)水平增高，與對照組相比差異尤為明顯(P值<0.05)，隨之分泌的NO水平亦明顯升高，由此推想NF-κB、iNOS、NO可能在肝臟疾病的炎癥中起重要作用。

綜上所述，慢性乙型肝炎實質(zhì)上亦屬于一種免疫性疾病，認(rèn)為導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的主要原因是HBV感染后激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，我們通過臨床與基礎(chǔ)的研究，發(fā)現(xiàn)可能存在NF-κB-iNOS-NO這樣一條信號通路，可能參與慢性乙肝的炎癥反應(yīng)過程，期望未來通過該通路挖掘出新的治療靶點(diǎn)。