楊一秋 李 蘭 趙 娜 解繼勝

1 右江民族醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生，廣西百色市 533000； 2 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，以降低骨量，破壞骨微結(jié)構(gòu)為特征，最終引起骨骼脆弱并增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡密切相關(guān)的骨骼疾病。最嚴(yán)重的后果是骨折，骨質(zhì)疏松性骨折危害巨大，給老年患者的生活帶來巨大痛苦并且對于家庭和社會來說也是一個沉重的負(fù)擔(dān)。MicroRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可以降解或抑制靶基因的蛋白表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。前期通過miRNA芯片技術(shù)分析人外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的miRNA，并通過實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果中上調(diào)或下調(diào)的miRNA。發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125a下調(diào)最為明顯，結(jié)果提示hsa-miR-125a可能是診斷骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物，但其具體調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此，本研究擬通過生物信息學(xué)分析方法預(yù)測hsa-miR-125a的靶基因及信號通路，為進(jìn)一步分析hsa-miR-125a在骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 hsa-miR-125a的物種保守性分析 利用miRBase(http://www.mirbase.org)數(shù)據(jù)庫檢索hsa-miR-125a的序列并分析其物種保守性。

1.2 hsa-miR-125a的靶基因預(yù)測 通過TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)、miRDB(http://mirdb.org)這三個靶基因數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測hsa-miR-125a的靶基因，對三者所預(yù)測的結(jié)果繪制venny圖，得到交集靶基因。

1.3 hsa-miR-125a預(yù)測靶基因的GO及KEGG信號通路富集分析 將hsa-miR-125a預(yù)測的靶基因集合，通過DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因本體(Gene ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析。GO分析包括細(xì)胞組分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)和生物過程(Biological process，BP)三個部分，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Fisher確切概率法計(jì)數(shù)基因集合生物通路的P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-125a的物種保守性分析 利用miRBase數(shù)據(jù)庫在線檢索人類、小鼠、大鼠等各種物種的miRNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p序列“UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA”、miR-125a-3p“ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC”在各物種間高度保守。

2.2 hsa-miR-125a的靶基因預(yù)測 TargetScan、miRTarBase、miRDB等3個靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，hsa-miR-125a靶基因分別有3 821、432、132個；三者交集靶基因有122個。 結(jié)果見圖1。

2.3 hsa-miR-125a預(yù)測靶基因的GO及KEGG分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的122個交集靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果表明，hsa-miR-125a的靶基因主要富集在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組件。參與金屬離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。涉及細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)泛素化的正調(diào)控等生物過程，結(jié)果見表1～3。KEGG信號通路分析結(jié)果表明hsa-miR-125a的靶基因信號通路顯著富集于endocytosis signaling pathway、adherens junction signaling pathway、TGF-β signaling pathway、HIF-1 signaling pathway，結(jié)果見表4。

圖1 miRTarBase、TargetScan、miRDB數(shù)據(jù)庫交集靶基因

表1 has-miR-125a預(yù)測靶基因的細(xì)胞組分

表2 hsa-miR-125a預(yù)測靶基因的分子功能

表3 hsa-miR-125a預(yù)測靶基因的生物過程

表4 hsa-miR-125a預(yù)測靶基因的KEGG信號通路分析

3 討論

miRNA是小的非編碼RNA，通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用(包括腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等)[3]。多項(xiàng)研究[4-8]表明miRNA通過靶向不同的基因調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化，從而參與骨質(zhì)疏松疾病進(jìn)程。前期研究證實(shí)hsa-miR-125a在破骨細(xì)胞分化過程中低表達(dá)，表明hsa-miR-125a可能是檢測骨質(zhì)疏松疾病的生物標(biāo)志物。但是其具體的調(diào)控機(jī)制仍然不明確。因而，本研究通過miRBase數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-125a物種的序列保守性進(jìn)行在線分析，檢索發(fā)現(xiàn)其在多個物種中均高度保守，說明這一段序列可能對于生物體有重要的生物學(xué)功能。再利用miRTarBase、TargetScan、miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-125a的靶基因，并通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明其生物過程主要集中在細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)泛素化的正調(diào)控等方面。

在KEGG信號通路分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-125a主要富集在endocytosis signaling pathway、adherens junction signaling pathway、TGF-β signaling pathway、HIF-1 signaling pathway，其中TGF-β signaling pathway在骨重塑過程中發(fā)揮重要作用。在骨吸收過程中，先前埋在骨基質(zhì)中的大量因子會釋放到骨髓微環(huán)境中，從而導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的募集和分化，以用于隨后的骨形成，在時間和空間上耦合骨重塑。破骨細(xì)胞骨吸收過程中基質(zhì)TGF-β的釋放與活化將MSC吸引到骨吸收部位，也就是說TGF-β的失調(diào)會改變MSC的命運(yùn)，使骨骼重塑失衡引起諸如骨質(zhì)疏松之類的骨骼疾病[9]。破骨細(xì)胞的分化主要受M-CSF信號、RANKL-RANK信號和基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)依賴的共刺激信號這三個重要信號通路的調(diào)節(jié)[10]。除了這三個典型的信號通路之外，TGF-β1信號在動態(tài)骨環(huán)境中起著關(guān)鍵作用，以很大程度上取決于細(xì)胞分化階段，TGF-β1濃度和其他培養(yǎng)條件的不同將會影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生長。例如，發(fā)現(xiàn)TGF-β1抑制成骨細(xì)胞分化，而TGF-β1的阻斷導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量增加[11]。另一項(xiàng)研究報(bào)道，TGF-β1誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[12]。但是，TGF-β1在破骨細(xì)胞形成中的確切作用仍然很復(fù)雜。前人研究表明，在低濃度(1～100pg/ml)下，TGF-β1促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，而在高濃度(0.1～10ng/ml)下，TGF-β1抑制破骨細(xì)胞的形成[13-14]。鑒于此，我們得知不同濃度的TGF-β1和培養(yǎng)方式將會影響破骨細(xì)胞的活性，所以hsa-miR-125a是否可以通過靶向TGF-β信號通路中不同的基因如：SMAD2、PPP2CA、 SMAD4、RHOA等來促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和分化，進(jìn)而加速骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)程，我們不得而知，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測了hsa-miR-125a的靶基因及信號通路，發(fā)現(xiàn)靶基因富集的信號通路TGF-β signaling pathway與破骨細(xì)胞分化密切相關(guān)。后期將以此作為理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索hsa-miR-125a在骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制。