龐揚(yáng)海，高裕鋒*，甄振鵬，黃敏興，余構(gòu)彬

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州 510316；2中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510316)

0 引言

5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)是美拉德反應(yīng)的主要副產(chǎn)物之一[1]?，F(xiàn)有研究表明，5-HMF對人體有潛在的危害，攝入過量的 5-HMF可能會造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，甚至可能會導(dǎo)致體內(nèi)基因突變[2-3]。紅糖是以甘蔗為原料，經(jīng)提取糖汁，清凈處理后，直接煮煉不經(jīng)分蜜制煉而成的食糖[4-6]。在紅糖的生產(chǎn)煮煉過程中容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[7]，從而產(chǎn)生 5-HMF[8]。建立一個準(zhǔn)確測定紅糖中 5-HMF的方法，用于準(zhǔn)確監(jiān)測紅糖中 5-HMF的含量顯得十分重要。

目前，食品中5-HMF的檢測方法有高效液相色譜法[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-12]和氣相色譜-質(zhì)譜法等[12-13]。采用高效液相色譜法檢測紅糖樣品中的5-HMF也已有報(bào)道[14]，但該方法檢出限為 0.05 mg/kg，其靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽性。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法將色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，與高效液相色譜法比較，可以有效提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。本文將采用超高效色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立適用于紅糖中5-HMF的檢測方法，并應(yīng)用此方法調(diào)研目前市面上銷售的紅糖中5-HMF的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB 5500 Q-Trap高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Milli-Q超純水器(美國密理博公司)；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；WIGGENS Vortex3000渦旋振蕩儀(北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)；N-EVAP112氮吹儀(美國 Organomation公司)；JE3002GE電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；XPE105電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

5-HMF(98.0%，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)；甲醇(色譜純，德國默克股份兩合公司)；乙腈(色譜純，德國默克股份兩合公司)；0.22 μm有機(jī)相濾膜(彼西絡(luò)科技(廣州)有限公司)；HLB固相萃取柱(3 mL，60 mg，美國沃特世公司)；PEP 固相萃取柱(3 mL，60 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司)；C18固相萃取柱(3 mL，200 mg，廣州太瑋生物科技有限公司)。紅糖樣品均在市場上隨機(jī)購買。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品10.20 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液(V/V=1/9)定容至刻度，配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃下避光保存。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液進(jìn)行逐級稀釋，用乙腈-水溶液(V/V=1/9)定容，配制成濃度分別為50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 提取和凈化

準(zhǔn)確稱取5.00 g紅糖樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-水溶液(V/V=5/95)，充分渦旋5 min，靜置(若有沉淀，以4900 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min)取4 mL上清液，待凈化。取待凈化液過已活化后的HLB柱，先用 2 mL甲醇-水溶液(V/V=5/95)淋洗，棄去淋洗液，再用6 mL甲醇洗脫并收集洗脫液。經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅? mL乙腈-水(V/V=1/9)充分溶解，混合均勻，過0.22 μm濾膜，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 LC條件

色譜柱：Phenomenex Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1 mm)；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫箱溫度45℃；流動相 A：水，流動相 B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；儀器參數(shù)：氣簾氣壓力275.8 kPa，碰撞氣檔位中檔，離子源電壓5500.0 V，離子源溫度550℃，噴霧氣壓力344.8 kPa，輔助加熱氣壓力344.8 kPa，接口加熱為開；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM，具體參數(shù)如表2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件選擇

表2 5-羥甲基糠醛的MRM質(zhì)譜參數(shù)

本研究對比了Phenomenex Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1 mm)和 Phenomenex Kinetex XB-C18柱(2.6 μm，100 mm×2.1 mm)對 5-HMF 的分析效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 5-HMF在 Phenomenex Kinetex XB-C18柱的出峰較快；而在 Phenomenex Luma Omega C18柱出峰較慢，峰型尖銳。由于紅糖中主要含的蔗糖、葡萄糖和果糖等是極性較大的物質(zhì)，在C18色譜柱上保留弱，為了避免目標(biāo)物和這些雜質(zhì)同時洗脫出來而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，所以本研究使用對5-HMF保留強(qiáng)和峰型更尖銳的 Phenomenex Luma Omega C18柱。

對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水作為流動相體系對5-HMF分析效果的影響。使用甲醇-水體系比使用乙腈-水體系5-HMF的保留時間更晚，峰型更對稱和尖銳，響應(yīng)更高。使用甲醇-水體系和使用甲醇-0.1%甲酸水體系相比，響應(yīng)相差不大，但是甲醇-0.1%甲酸水體系目標(biāo)峰出現(xiàn)后拖尾現(xiàn)象。因此本文選取甲醇-水作為流動相體系。

質(zhì)譜條件優(yōu)化方法是：在注射泵直接進(jìn)樣的條件下，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定5-HMF的分子離子峰，然后以該分子離子峰為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，獲得二級質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)的2個子離子，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行采集，并獲得去簇電壓和碰撞能量等相關(guān)參數(shù)[15]，具體參數(shù)如表2所示，使所測的質(zhì)譜峰強(qiáng)度最優(yōu)。

在上述優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，獲得的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)的總離子流色譜圖

2.2 提取溶液和凈化方式選擇

本研究比較了甲醇-水(V/V=5/95)、甲醇-水(V/V=1/9)、甲醇-水(V/V=2/8)、乙腈-水(V/V=5/95)、乙腈-水(V/V=1/9)和乙腈-水(V/V=2/8)對紅糖中5-HMF提取效率的影響，結(jié)果表明甲醇-水(V/V=5/95)和乙腈-水(V/V=5/95)的提取效果相當(dāng)而且優(yōu)于其他4種溶液，綜合毒性和價(jià)格考慮，選用毒性相對較小和價(jià)格較便宜的甲醇-水為提取溶劑。

紅糖的主要成分是蔗糖、色素和氨基酸等[7,16-17]，凈化除去這些物質(zhì)，既有利于提高5-HMF的回收率又可以延長色譜柱壽命。HLB柱、PEP柱和C18柱均能吸附5-HMF，通過淋洗液淋洗可以除去大部分極性比5-HMF大的蔗糖、色素和氨基酸等雜質(zhì)。因此本文通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)比較了使用這3款固相萃取柱的凈化效果和5-HMF的回收率。結(jié)果表明使用這3款固相萃取柱的凈化后，得到的上機(jī)待測液均是澄清透明的，使用HLB柱所得到的5-HMF的回收率優(yōu)于PEP柱和C18柱。因此選擇使用HLB柱凈化紅糖樣品。

2.3 方法線性范圍和檢出限

配制濃度為 50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按1.4的儀器方法分析，以5-HMF的濃度為橫坐標(biāo)(x)，各濃度對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，獲得目標(biāo)物的線性方程和相關(guān)系數(shù)，見表3。

加標(biāo)后的空白紅糖樣品經(jīng)過前處理得到的樣液，按 1.4的條件與方法進(jìn)行分析，根據(jù)信噪比為3(S/N=3)和樣液的稀釋倍數(shù)計(jì)算得到檢出限(LOD)，根據(jù)信噪比為 10(S/N=10)和樣液的稀釋倍數(shù)計(jì)算得到定量限(LOQ)。結(jié)果顯示，紅糖樣品中 5-羥甲基糠醛檢出限為 0.44 μg/kg，定量限為 1.47 μg/kg，見表3。

表3 5-羥甲基糠醛的方法檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 回收率和精密度

取紅糖樣品，分別在2.0、5.0、10.0 μg/kg濃度水平下加標(biāo)，每個濃度分別做6個平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到在各個加標(biāo)水平下5-HMF的回收率在86.3%～97.8%范圍內(nèi)，精密度在 2.1%～5.0%范圍內(nèi)，詳見表4。

表4 紅糖中5-羥甲基糠醛平均回收率和精密度數(shù)據(jù)表(n=6)

2.5 實(shí)際樣品測試

按照本研究建立的方法，對在市面上隨機(jī)購買的25份紅糖樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示這25份紅糖樣品均檢出5-HMF，含量范圍為 6.43～533 μg/kg。這表明紅糖樣品在生產(chǎn)過程中確實(shí)會產(chǎn)生 5-HMF；參照《中國藥典(一部)》對蜂蜜日食用量為15～30 g，5-HMF含量不得超過 0.004%的規(guī)定[18]，目前測得的紅糖中 5-HMF殘留值對人體可能產(chǎn)生的健康風(fēng)險(xiǎn)是較低的。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了紅糖中5-羥甲基糠醛的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。結(jié)果表明，5-HMF在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法檢出限為0.44 μg/kg，定量限為 1.47 μg/kg；在 2.0、5.0、10.0 μg/kg濃度水平下加標(biāo)，平均回收率為 86.3%～97.8%。本方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性和凈化效果好，適用于紅糖中5-HMF的殘留量測定。需要補(bǔ)充說明的是，本研究暫未對日間回收率和日間精密度進(jìn)行研究，這將在日后的進(jìn)一步研究中進(jìn)行優(yōu)化。