鄭莛予，陳杰博，王 璐，鄭明鋒，汪 鵬，褚杜娟

(1福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福建福州350002；3福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建福州350002)

0 引言

丙烯酰胺(Acrylamide)，其化學(xué)式為 C3H5NO，在常溫下為白色晶體狀，無(wú)氣味，易溶于水、乙醇、丙酮等極性溶劑中。人體可以通過(guò)消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收丙烯酰胺。1993年世界衛(wèi)生組織將其評(píng)估為致癌風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。1994年，丙烯酰胺被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2A級(jí)致癌物[1]。2002年4月，瑞典國(guó)家食品管理局宣布在加工食品中發(fā)現(xiàn)了丙烯酰胺，此后食品中的丙烯酰胺得到了廣泛的關(guān)注[2]。加工食品中的丙烯酰胺多產(chǎn)生于食品內(nèi)部的美拉德反應(yīng)，因此在咖啡、面包、薯片或其他經(jīng)過(guò)熱處理的淀粉類食品陸續(xù)檢測(cè)出了丙烯酰胺[3-8]。

在中國(guó)，紅糖不僅作為一種甜味劑，還是一種功能食品，中醫(yī)認(rèn)為紅糖具有滋補(bǔ)氣血、健脾養(yǎng)胃等功能，女性在月子、月經(jīng)期間大量飲用紅糖及其制品，這被認(rèn)為具有排惡露和暖宮的作用?，F(xiàn)代研究表明，紅糖富含酚類、維生素、礦物質(zhì)以及多種人體必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]，具有抗氧化、防衰老和美容養(yǎng)顏等功效。作為紅糖生產(chǎn)的原料——甘蔗汁，其富含葡萄糖、果糖等還原糖和天冬氨酸等氨基酸，這些在蔗汁熬煮過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)和褐變反應(yīng)，使紅糖產(chǎn)生特有的香味和顏色，也產(chǎn)生了中醫(yī)認(rèn)為的紅糖的溫?zé)釋傩?，但同時(shí)，還原糖與氨基酸發(fā)生的美拉德反應(yīng)也容易產(chǎn)生如丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛等有害物質(zhì)。Hoenicke[10]、Cheng[11]采用LC/MS/MS和GC-MS等對(duì)當(dāng)?shù)丶t糖/黑糖的丙烯酰胺進(jìn)行了抽樣檢測(cè)；Gómez-Narváez[12]等對(duì)南美洲和歐洲等國(guó)家的 2種不同外觀形式的紅糖“Panela”共計(jì)40款進(jìn)行了丙烯酰胺檢測(cè)，這2種形式的紅糖中均檢測(cè)出了丙烯酰胺，部分紅糖中的丙烯酰胺含量高達(dá)2632 ug/kg±111 ug/kg。但是，目前食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要是基于高淀粉類食品，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[13-14]。質(zhì)譜在定量檢測(cè)中運(yùn)用廣泛，且具有更高的靈敏度與精確度，但質(zhì)譜的檢測(cè)成本昂貴，對(duì)儀器、試劑和樣品的前處理要求很高，大多需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化或固相萃取技術(shù)。Castle[15]等對(duì)丙烯酰胺的溴化使其具有了高揮發(fā)性，使得溴化后的丙烯酰胺可應(yīng)用于氣相色譜檢測(cè)中，提高了檢測(cè)的選擇性，但溴化方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，需要嚴(yán)苛的溫度控制，并且溴化液對(duì)環(huán)境造成污染。Pedersen[16]等基于索氏提取方法，用甲醇連續(xù)提取樣品10天后無(wú)需衍生化便可用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。Cavalli[17]等采用固相萃取設(shè)備(SPE)與加速固相萃取裝置(ASE)結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行除雜處理，丙烯酰胺的回收率為60%～95%。Achim[18]采用離子肼LC-ESI-MS/MS檢測(cè)丙烯酰胺，檢出限低至0.55 ng/mL。紅糖主要成分是糖分，其最大的特點(diǎn)是具有高的水溶性，這些基于高淀粉樣品發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法，由于需要對(duì)樣品中的淀粉、油脂等組分進(jìn)行去除，存在著操作繁瑣、設(shè)備要求高、檢測(cè)成本高等問(wèn)題。然而，紅糖的糖分和丙烯酰胺均為強(qiáng)極性物，這就需要更多關(guān)注強(qiáng)極性組分之間的分離作用，因此，開發(fā)如紅糖高水溶性樣品的丙烯酰胺快速、低成本的檢測(cè)方法，對(duì)保證紅糖食品安全具有重要的意義。

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有高效、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。Hypercarb液相色譜柱采用獨(dú)特的100%多孔石墨碳作為填料，它的化學(xué)表面特性明顯區(qū)別于傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)填料，如鍵合硅膠及聚合物等[19-20]，對(duì)高極性分析物具有出色的保留能力[21-22]。丙烯酰胺在210 nm左右有較強(qiáng)的紫外吸收，而蔗糖、葡萄糖等糖組分沒(méi)有紫外吸收，可以減少糖分對(duì)丙烯酰胺檢測(cè)的干擾。因此，采用HPLC-UV結(jié)合Hypercarb色譜柱，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)紅糖中丙烯酰胺的快速高效低廉的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種不同品牌的紅糖，購(gòu)自福州超市和淘寶網(wǎng)；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇(色譜純)，美國(guó)Thermo Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水機(jī)系統(tǒng)制得。所有的試劑和溶液在進(jìn)入檢測(cè)器之前都要用0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，超聲除氣。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)配2998光電二極管矩陣(PDA)檢測(cè)器，美國(guó)Waters科技有限公司；Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)，美國(guó)Thermo Fisher公司；電子分析天平(感量0.1 mg)，瑞士梅特勒-托利多國(guó)際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g，用去離子水溶解后置于1000 mL容量瓶中，用去離子水定容，配置成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的丙烯酰胺溶液，再取1 mL該溶液于棕色容量瓶中稀釋至100 mL，配置成0.5 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紅糖樣品的前處理

分別取上述10種紅糖適量，研磨成粉，準(zhǔn)確稱取0.50 g(精確到0.01 g)紅糖樣品充分?jǐn)嚢枞芙?，配置成不同溶度的紅糖溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾后用于高效液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱選擇 Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)；進(jìn)樣量 20 μL；色譜柱溫度35℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水(15∶85，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，利用保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取不同體積(0.2、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 mL)的1.3.1節(jié)配制的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用去離子水定容于10 mL容量瓶中，渦旋振蕩搖勻，配制成濃度分別為 0.01、0.04、0.07、0.10、0.13、0.16 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品工作液，分別進(jìn)行HPLC分析。以質(zhì)量溶度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

在相同的色譜條件下進(jìn)行樣品的測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品丙烯酰胺的保留時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行定性，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

由于甲醇在200 nm處具有紫外吸收，而丙烯酰胺在190～240 nm之間有紫外吸收，因此，吸收波長(zhǎng)的選擇對(duì)樣品檢測(cè)靈敏度有重要的影響。通過(guò)對(duì)15%甲醇水溶液流動(dòng)相和丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波長(zhǎng)掃描比較，可以看到丙烯酰胺在200 nm處有最大的吸收(圖1)，但在210 nm處流動(dòng)相的響應(yīng)值遠(yuǎn)低于200 nm處(圖1)，其紫外吸收光譜受流動(dòng)相基質(zhì)干擾小，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

圖1 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)分離效果的影響

丙烯酰胺是強(qiáng)極性化合物，在反相色譜柱上的保留較弱，流動(dòng)相常采用有機(jī)溶劑和水的混合物，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，可以得到較為理想的分離效果。本研究采用黏度和毒性較低的甲醇進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考察流動(dòng)相酸性對(duì)分離效果的影響，由圖2可見，隨著流動(dòng)相甲醇含量的增加，流動(dòng)相對(duì)丙烯酰胺的洗脫能力增強(qiáng)，其保留時(shí)間由 3.8 min減少至2.0 min，甲醇含量的增加，丙烯酰胺的峰型逐漸尖銳，當(dāng)甲醇含量為15%時(shí)，基線平穩(wěn)，沒(méi)有明顯的漂移，丙烯酰胺的峰型尖銳，對(duì)稱性良好，保留時(shí)間較為適宜，避開了雜質(zhì)峰的干擾。而在流動(dòng)相中添加磷酸時(shí)，基線漂移較為嚴(yán)重。綜上，選擇15%的甲醇水溶液作為流動(dòng)相。

圖2 流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響

2.1.3 樣品濃度

紅糖大部分的組分具有較強(qiáng)的水溶性，紅糖溶液的濃度對(duì)丙烯酰胺與其他組分的分離有重要影響，紅糖水濃度高容易造成其他組分對(duì)丙烯酰胺色譜峰的掩蓋，而濃度低，丙烯酰胺峰不明顯。因此，采用15%甲醇水溶液作為流動(dòng)相，1.0 mL/min的流速，210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，圖3比較6種不同濃度的紅糖水溶液(1%、2%、5%、10%、20%、30%)丙烯酰胺的分離效果。隨著紅糖水溶液濃度的增加，丙烯酰胺色譜峰逐漸明顯，當(dāng)紅糖濃度為20%，能明顯看到丙烯酰胺峰，繼續(xù)提高紅糖濃度至30%時(shí)，基線漂移較大，紅糖中雜質(zhì)對(duì)丙烯酰胺峰造成了干擾，同時(shí)紅糖溶液的粘性增加，可能使色譜柱堵塞的幾率增大，從而可能降低色譜柱的使用壽命，故選擇20%紅糖溶液作為紅糖中丙烯酰胺檢測(cè)的最佳濃度。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系與最低檢出限

圖3 9號(hào)紅糖樣品溶液的濃度對(duì)分離效果的影響

將濃度為0.01～0.16 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣，采用HPLC進(jìn)行分析。相同質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取3次進(jìn)樣的平均峰面積(y，mAU)及標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸。丙烯酰胺在0.01～0.16 μg/mL范圍內(nèi)峰面積和質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.5224x+0.0020(r2=0.9991)，如圖4所示。

圖4 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

檢出限是衡量?jī)x器或方法靈敏度的指標(biāo)，定性檢出限(LOD)是在色譜圖上可以清楚確認(rèn)地分析目的物色譜峰的下限，通常為噪音的3倍，定量檢出限(LOQ)指樣品按照分析方法的要求進(jìn)行提取處理并檢測(cè)，能區(qū)分于噪聲的最低檢出濃度，通常為噪音的10倍。分別取3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算該方法的檢出限(LOD)為 0.003 μg/mL和定量限(LOQ)為 0.01 μg/mL。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見圖5。

2.2.2 樣品加標(biāo)回收率和精密度

方法的準(zhǔn)確度由加標(biāo)回收率進(jìn)行評(píng)定。取實(shí)驗(yàn)配制的等體積的9號(hào)紅糖樣品溶液3份，分別添加體積分?jǐn)?shù)低、中、高3個(gè)水平(0.018、0.042和0.064 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定丙烯酰胺的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算丙烯酰胺的加標(biāo)回收率。日內(nèi)精密度和日間精密度用于評(píng)估方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性。日內(nèi)精密度為在一天內(nèi)平行測(cè)定 5次樣品，而日間精密度為連續(xù)3天進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示。如表1所示，丙烯酰胺在低、中、高的平均回收率分別為93.4%、86.4%和 92.0%，方法的平均日內(nèi)精密度為 1.06%、3.29%、2.69%，平均日間精密度為 3.86%、2.34%、4.40%，說(shuō)明本方法的隨機(jī)誤差較小，因而可以滿足定量分析。

圖5 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

表1 9號(hào)紅糖樣品中丙烯酰胺的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 樣品分析及含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后獲得了最優(yōu)HPLC分析條件：以 Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)進(jìn)行分離；流動(dòng)相∶甲醇-去離子水(15∶85，V/V)；流動(dòng)相流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫35℃。圖6為其中一個(gè)紅糖樣品的色譜圖。

圖6 紅糖樣品高效液相色譜圖

對(duì)市售的10個(gè)紅糖樣品按1.3.2節(jié)步驟進(jìn)行預(yù)處理，并采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法進(jìn)行分析，將這些樣品的色譜圖和丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行比較，樣品在2.4 min附近均有色譜峰出現(xiàn)，表明這些市售紅糖樣品均含有丙烯酰胺，詳見表2。樣品全部檢出丙烯酰胺，檢出濃度范圍為 243.67～1739.33 μg/kg，最高含量達(dá)1739.33 μg/kg，平均含量為806.52μg/kg。目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅糖中丙烯酰胺的含量并沒(méi)有相關(guān)政策進(jìn)行約束，但歐盟自2017年便已實(shí)施關(guān)于丙烯酰胺的相關(guān)法規(guī)[23]。該法規(guī)所規(guī)定的大部分食品中的丙烯酰胺都必須低于500 μg/kg，兒童食品更是低至 40 μg/kg，結(jié)合本研究結(jié)果，過(guò)半樣品的丙烯酰胺含量都超過(guò)500 μg/kg，因此精確定量并控制紅糖中丙烯酰胺的含量是十分重要的，過(guò)量丙烯酰胺對(duì)食品安全存在的風(fēng)險(xiǎn)的影響應(yīng)當(dāng)引起國(guó)家監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)的重視。

表2 各紅糖樣品中丙烯酰胺的含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了紅糖中丙烯酰胺的高效液相色譜檢測(cè)方法，該方法為高水溶性食品中丙烯酰胺的分離檢測(cè)提供了指導(dǎo)。運(yùn)用該方法丙烯酰胺實(shí)現(xiàn)了快速高效的分離，樣品加標(biāo)回收率為 86.4%～93.4%，日內(nèi)精密度在 1.06%～3.29%，日間精密度在2.34%～4.40%。該方法定性檢出限為0.003 μg/mL，定量限為0.01 μg/mL。本方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需固相萃取，簡(jiǎn)化了樣品預(yù)處理操作步驟；與目前廣泛運(yùn)用的檢測(cè)方法相比，本方法大幅降低了檢測(cè)成本；對(duì)所需液相色譜儀器的要求較低，可在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具有較好的推廣價(jià)值。