王小鵬，黃敏興*，許卓妍，楊李勝，劉志鵬，余構(gòu)彬

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2中國(guó)輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

植物類多酚是多羥基酚類化合物的總稱，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)具有獨(dú)特生物活性的次生代謝物。作為植物天然產(chǎn)物，植物多酚因其結(jié)構(gòu)的多樣性而具有多種生物活性[1]。近年來(lái)，植物多酚的生物活性及功能性作用不斷被挖掘。相關(guān)研究表明，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、食品保鮮、抑菌抗菌、抗病毒、抑制癌癥、治療心腦血管疾病等多種功能性作用[2-4]。隨著植物多酚研究領(lǐng)域往縱深方向發(fā)展，進(jìn)一步細(xì)化多酚物質(zhì)的分類以及功能性作用具有深遠(yuǎn)意義。而高效高靈敏度的定性定量檢測(cè)方法能夠明確多酚的組分組成及各組分的含量，是多酚功能性作用走向精細(xì)化研究的重要技術(shù)支撐手段。因此針對(duì)不同植物基質(zhì)特性，開(kāi)發(fā)專屬性較強(qiáng)的高效高靈敏度檢測(cè)方法具有重要意義。

甘蔗是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是食糖生產(chǎn)的重要來(lái)源，年產(chǎn)量居世界第 3，但與外國(guó)制糖產(chǎn)業(yè)相比，我國(guó)甘蔗制糖產(chǎn)業(yè)整體經(jīng)濟(jì)效益存在一定差距，主要體現(xiàn)在綜合利用率不高，甘蔗及其副產(chǎn)物資源高值化利用率相對(duì)較低，因此提高甘蔗及其副產(chǎn)物的高值化利用將成為提升甘蔗制糖行業(yè)整體經(jīng)濟(jì)效益的必經(jīng)之路。甘蔗組織中含有豐富的多酚物質(zhì)，提取甘蔗多酚并進(jìn)行功能性應(yīng)用研究將是甘蔗高值化利用的重要途徑[5-7]。

甘蔗中多酚定性定量檢測(cè)方法是功能性應(yīng)用研究的重要技術(shù)支撐手段，但當(dāng)前甘蔗多酚檢測(cè)方面的研究主要集中在提取階段，高效高靈敏度的多組分多酚檢測(cè)方法研究相對(duì)較少。目前多酚物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13-15]等。高效液相色譜法易受復(fù)雜基質(zhì)的干擾，對(duì)分析多種多酚具有一定的局限性。而液相色譜-質(zhì)譜法具有強(qiáng)大的抗干擾能力，靈敏度高，可以準(zhǔn)確定性定量。本文擬以甘蔗為研究對(duì)象，建立甘蔗中11種多酚的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為甘蔗多酚的功能性應(yīng)用研究提供技術(shù)支撐手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Altus A-30超高效液相色譜儀(美國(guó)鉑金埃爾默公司)，5500 Qtrap質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司)，色譜柱Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)(美國(guó)沃特世公司)；WIGGENS Vortex 3000渦旋振蕩器(北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)。

11種多酚標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.5%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，默克股份兩合公司)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；0.22 μm有機(jī)相濾膜(廣州彼西絡(luò)科技有限公司)。

1.2 樣品前處理

將廣州市面上采購(gòu)的新鮮甘蔗洗凈，放入攪拌機(jī)攪碎，稱取2.00 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，渦旋10 min，40℃超聲60 min，以5000 r/min速度離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A；1.0～5.0 min，90%～10% A；5.0～8.5 min，10% A；8.5～8.6 min，10%～90% A；8.6～10.0 min，90% A；流速：0.5 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子電離(ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力：55 psi；氣簾氣壓力：44 psi；輔助加熱氣壓力：40 psi；碰撞氣壓力：中檔。定量和定性離子、去簇電壓等參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

表1 11種多酚物質(zhì)的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm ×2.1 mm)、Ultra AQ C18(3 μm，100 mm×2.1 mm)、Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)3 種不同色譜柱對(duì) 11種多酚物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明，Atlantis T3色譜柱對(duì)11種多酚物質(zhì)較另外2種色譜柱具有更好的保留和分離效果，目標(biāo)化合物峰形不會(huì)出現(xiàn)分叉，拖尾現(xiàn)象不明顯，響應(yīng)值高，3種色譜柱的分離效果見(jiàn)圖1～3，因此，本實(shí)驗(yàn)選用Atlantis T3色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

圖1 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱對(duì)11種多酚物質(zhì)分離效果

圖2 Ultra AQ C18色譜柱對(duì)11種多酚物質(zhì)分離效果

圖3 Atlantis T3色譜柱對(duì)11種多酚物質(zhì)分離效果

采用針對(duì)極性物質(zhì)分析效果較好的Atlantis T3(3 μm，150 mm×3.0 mm)色譜柱，分別比較了超純水-乙腈、0.01%氨水-乙腈、0.01%氨水-甲醇、超純水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇 5種不同流動(dòng)相組合的分離效果。結(jié)果表明，采用0.1%甲酸水-甲醇流動(dòng)相組合能最大程度上調(diào)節(jié)酸度，抑制解離，提高靈敏度，且峰形尖銳對(duì)稱，分離度好，故選擇 0.1%甲酸水-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法結(jié)合超聲萃取法。多數(shù)文獻(xiàn)[16-17]采用丙酮、乙酸乙酯、甲醇分步提取多酚物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)比較后精化了提取步驟，只用甲醇作為提取溶劑。為了進(jìn)一步探究提取溶劑濃度(60%甲醇水、80%甲醇水、100%甲醇)、超聲時(shí)間(30、60、120 min)、超聲溫度(40、60、80℃) 3個(gè)因素3個(gè)水平對(duì)最終實(shí)驗(yàn)的影響，利用正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)設(shè)計(jì)出來(lái)的 9個(gè)具有代表性的組合進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)探究，具體正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)選擇純甲醇(100%甲醇)作為提取溶劑，溫度40℃超聲60 min時(shí)可以達(dá)到最佳提取效果，平均加標(biāo)回收率為93.2%。

2.3 回收率和精密度

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

采用逐級(jí)稀釋法結(jié)合3倍濃度除以信噪比計(jì)算得到 11種多酚物質(zhì)的檢出限。在空白樣品中加入100 μg/kg的11種多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)線性范圍為5～200 μg/L時(shí)，其相關(guān)系數(shù)在0.9990～1.0000之間，檢出限在0.5～17.0 μg/kg之間，回收率在89.4%～102.4%之間，精密度在0.9%～4.3%之間。

2.4 樣品分析

對(duì)來(lái)自廣東不同種植區(qū)域采集的6份甘蔗樣品進(jìn)行不同部位的試驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，6份甘蔗樣品均檢出香草酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、兒茶素、阿魏酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸、槲皮素、原花青素B2，未檢出表兒茶素、反鄰香豆酸。

3 結(jié)論

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度(n=6)

表4 11種多酚類物質(zhì)在甘蔗中的檢測(cè)結(jié)果 單位：mg/kg

本研究通過(guò)對(duì)前處理、色譜、質(zhì)譜等條件的優(yōu)化，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定甘蔗中11種多酚類物質(zhì)的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、高效，且回收率及精密度均滿足實(shí)驗(yàn)要求，選擇性強(qiáng)，適應(yīng)性良好，可用于甘蔗中多酚類物質(zhì)含量的批量測(cè)定。同時(shí)也為甘蔗各部位的充分利用、有益物質(zhì)開(kāi)發(fā)、組織培養(yǎng)降低酚害提供了技術(shù)參考。