劉霞

摘要：2020年9月山東濱州某鴨場(chǎng)內(nèi)雛鴨陸續(xù)發(fā)病死亡，根據(jù)發(fā)病情況初步分析是鴨傳染性漿膜炎。經(jīng)過臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最終確診為鴨疫里默氏桿菌感染，經(jīng)過積極治療，疫情得到有效控制。本研究對(duì)該發(fā)病鴨場(chǎng)病料開展了實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢驗(yàn)，并成功保存一株命名為RA-T的鴨疫里默氏桿菌。

關(guān)鍵詞：鴨；鴨疫里默氏桿菌；RA-T株

鴨傳染性漿膜炎俗稱鴨疫等，是養(yǎng)鴨業(yè)中常發(fā)的一種細(xì)菌類傳染性疾病，其致病菌為鴨疫里默氏桿菌。研究發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌的血清型眾多，有21種，但不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)。當(dāng)前鴨疫里默氏桿菌病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一，該病在全世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)鴨疫里默氏桿菌病也很嚴(yán)重，已有研究報(bào)道的血清型多達(dá)10種以上，在養(yǎng)鴨過程中對(duì)鴨疫里默氏桿菌病的防治存在一定的困難。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，隨著季節(jié)交替，早晚溫差加大，使得近期鴨場(chǎng)各類疾病突增，尤其以鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率升高最為明顯。2020年9月，山東某鴨場(chǎng)鴨群突然發(fā)病，病鴨精神萎靡，不愿走動(dòng)，眼鼻有漿液性分泌物，下痢且糞便呈黃綠色，瀕死鴨多表現(xiàn)頭向后背、兩腳伸直、搖頭等神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率日益增多。對(duì)病死鴨剖檢可見肝臟、心臟表面有灰白色纖維素性滲出物覆蓋，腦膜充血，氣囊壁增厚，呈纖維素性氣囊炎。結(jié)合臨床癥狀及病理變化初步診斷為鴨疫里默氏桿菌病。本文主要介紹了此次診治過程的實(shí)驗(yàn)室研究?jī)?nèi)容，以期對(duì)其他類似病癥的檢驗(yàn)給與幫助。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集山東濱州某規(guī)模養(yǎng)鴨場(chǎng)中病死鴨的鴨頭。

1.1.2主要試劑天津康源生物科技有限公司的新生牛血清（批號(hào)：20190718），TSA培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司購(gòu)買的生化發(fā)酵管和藥敏片，含5%牛血清的TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基。鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)引物：RA-F：GACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGT，RA-R：TAACTGAGATGGGTTAACACCTCTAGC。

1.2方法

1.2.1病料細(xì)菌分離及純化將采集的病料組織分別劃線接種到麥康凱和含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，麥康凱培養(yǎng)基放置在恒溫培養(yǎng)箱中，TSA培養(yǎng)基放置在厭氧罐里，37℃培養(yǎng)18h。然后挑取典型的單個(gè)菌落劃線接種到5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。

1.2.2菌體染色及鏡檢將分離菌的純培養(yǎng)物采用革蘭氏染色的方法進(jìn)行染色，并在1，000倍的油鏡下進(jìn)行鏡檢觀察，記錄菌體的形態(tài)和染色特性。

1.2.3 PCR擴(kuò)增取疑似鴨疫里默氏桿菌分離菌作為PCR模板，PCR體系為：10μL 2×Taq PCR Master Mix，1μL模板，RA-F 0.5μL，RA-R 0.5μL，補(bǔ)無菌H2O至總體積20μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)后取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入到1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳約25min后，在凝膠成像儀上照相觀察。

1.2.4生化試驗(yàn)按照常規(guī)方法，對(duì)可疑菌純培養(yǎng)物分別接種葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、過氧化氫及尿素等微量生化鑒定管，然后將各微量生化鑒定管放置到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察結(jié)果。

1.2.5藥敏試驗(yàn)將分離菌純培養(yǎng)物均勻涂布在含4%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，再分區(qū)平貼上卡那霉素、利福平、氨芐西林、鏈霉素、青霉素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑、頭孢氨芐、阿奇霉素、阿莫西林、新霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、多粘菌素B、頭孢噻肟共計(jì)18種常用藥敏片，在37℃厭氧罐里培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的有無及直徑大小。

1.2.6分離菌株毒力試驗(yàn)14日齡健康雛鴨10只，分成兩組：試驗(yàn)組和對(duì)照組，5只/組。試驗(yàn)組雛鴨通過頸部皮下接種0.2mL菌液，含菌量為1×108CFU，對(duì)照組雛鴨不做處理。將兩組雛鴨分別隔離飼養(yǎng)10d。同時(shí)觀察各組雛鴨健康情況，如有死鴨需解剖觀察病理變化并進(jìn)行細(xì)菌分離。

2結(jié)果

2.1分離純化

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)；在含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上出現(xiàn)圓形突起、邊緣整齊、不溶血的露珠樣菌落，直徑約1.5～2mm。斜射光下可呈現(xiàn)淡綠色熒光。

2.2鏡檢

典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可見分離菌為無芽胞的陰性桿菌，兩端鈍圓，多數(shù)單個(gè)存在，也有少數(shù)兩個(gè)排列或呈短鏈排列的形態(tài)。與鴨疫里默氏桿菌鏡檢特征相符。

2.3生化試驗(yàn)

該分離菌株與糖類和醇類反應(yīng)為陰性，可見不與糖類和醇類發(fā)生反應(yīng)，但能夠與過氧化氫和尿素發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果呈陽性。由此可見該分離菌株的生化特性與鴨疫里默氏桿菌相近。

2.4 PCR結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，以分離菌株為模板獲得的片段大小與預(yù)期的鴨疫里默氏桿菌目的片段一致，由此可確定該分離菌為鴨疫里默氏桿菌，將其命名為RA-T。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)磺胺異惡唑、頭孢氨芐高度敏感，對(duì)利福平、丁胺卡那、頭孢噻肟中度敏感，對(duì)新霉素、多黏菌素B低度敏感，其余11種均不敏感。

2.6動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組雛鴨攻毒24h后陸續(xù)出現(xiàn)精神倦怠，呆立不動(dòng)，蜷縮在角落，食欲下降，拉綠色或灰黃色稀便，頭向后背、兩腳伸直等癥狀，48h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組雛鴨未見異常，健康生長(zhǎng)。24h內(nèi)死亡鴨解剖后病變不明顯，48h死鴨可見心臟、肝臟表面均有明顯的纖維素樣滲出。取病死鴨的鴨頭及肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，均可以分離到鴨疫里默氏桿菌。

3討論

本研究根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢，并結(jié)合細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)及PCR檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)操作，成功從山東省某養(yǎng)鴨場(chǎng)病死鴨腦組織中分離出了1株鴨疫里默氏桿菌。本試驗(yàn)選用18種常規(guī)用藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該分離株對(duì)不同藥物的敏感程度有所差異，耐藥性也比較嚴(yán)重，分析原因可能與日常養(yǎng)殖過程中抗生素的長(zhǎng)期不合理使用有關(guān)。在臨床防治鴨疫里默氏桿菌時(shí)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用藥物，同時(shí)交替使用2～3種敏感藥物，不僅可以取得良好的治療效果，也可以避免藥物耐藥性的產(chǎn)生。隨著人們對(duì)食品安全的重視，養(yǎng)鴨業(yè)中抗生素的使用逐漸受到限制。耐藥性分析是在防控中用藥治療的依據(jù)，合理規(guī)范使用抗菌素在一定程度上可以避免耐藥性的產(chǎn)生。因此在鴨疫里默氏桿菌病臨床診治中進(jìn)行分離鑒定和對(duì)其藥敏性的研究至關(guān)重要。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)隨著天氣逐漸變涼，晝夜溫差加大，近期鴨場(chǎng)多種疫病發(fā)病率持續(xù)升高。鴨疫里默氏桿菌病的發(fā)病與鴨場(chǎng)衛(wèi)生條件狀況及飼養(yǎng)方法有很大關(guān)系，該養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)養(yǎng)殖密度過大，加之近期陰雨天氣的影響，地面潮濕，通風(fēng)差，進(jìn)而導(dǎo)致了此次疫情的發(fā)生。從病料分離的致病菌來看，鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率約占74%。由于鴨疫里默氏桿菌病、大腸桿菌病兩者在剖檢變化等方面極為相似，應(yīng)予以區(qū)別。通常大腸桿菌病不出現(xiàn)全身抽搐、角弓反張等神經(jīng)癥狀，剖檢后腸道病變更明顯，兩者都可以形成肝臟表面的纖維素滲出物，但鴨疫里默氏桿菌病形成的更薄、更干燥、更易剝離。

鴨疫里氏桿菌病對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害極大。惡劣的飼養(yǎng)環(huán)境、不科學(xué)的養(yǎng)殖方式是誘發(fā)鴨疫里氏桿菌病的重要因素，因此在養(yǎng)殖過程中，一定要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，采取合理的飼養(yǎng)密度，保持適宜的溫濕度，保持空氣的充分流通，一旦發(fā)病，及時(shí)隔離診治。目前預(yù)防鴨疫里氏桿菌最有效的方法是科學(xué)制定免疫程序，選用安全有效的疫苗，對(duì)鴨群接種鴨疫里氏桿菌類疫苗，使鴨群產(chǎn)生免疫抗體，來抵御疾病的發(fā)生。鴨疫里氏桿菌油佐劑滅活疫苗免疫9日齡左右雛鴨，免疫14d后對(duì)鴨群進(jìn)行二免，通常免疫效果較好。█