王偉超，古幸靈，周主貴，劉麗敏，劉紅堅(jiān)，李毅杰，段維興，雷敬超，黃思良，譚宏偉，劉平武，林善海,,

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；4.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061）

0 引言

甘蔗是我國(guó)重要的糖料作物［1］，隨著新臺(tái)糖系列甘蔗品種的引進(jìn)和推廣種植，甘蔗梢腐病在我國(guó)發(fā)生呈加重趨勢(shì)，已經(jīng)成為甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中的主要病害［2］，嚴(yán)重影響甘蔗的產(chǎn)量與質(zhì)量。甘蔗梢腐病是由鐮刀菌侵染引起的一種真菌性葉部病害［3］，國(guó)外現(xiàn)已報(bào)道的甘蔗梢腐病病原有7種，分別為F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferarum、F.subglutinans、F.andiyazi、F.incarnatum和F.oxysporum［4-7］，但不同國(guó)家和蔗區(qū)的病原種群及優(yōu)勢(shì)種存在差異。馬來(lái)西亞已報(bào)道的種有3個(gè)，分別為F.sacchari、F.proliferatum和F.subglutinans，以F.sacchari為主［8-9］。伊朗目前報(bào)道有3種，分別為F.verticillioides、F.proliferatum和F.subglutinans，優(yōu)勢(shì)種為F.verticillioides［10-11］。南非報(bào)道的3個(gè)種為F.sacchari、F.proliferatum和F.andiyazi，優(yōu)勢(shì)種為F.sacchari［12］。我國(guó)已報(bào)道甘蔗梢腐病病原有5個(gè)種，分別為F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferatum、F.andiyazi和F.oxysporum［6,13-15］,Lin等［16］和Meng等［13］的研究結(jié)果表明甘蔗鐮刀菌（F.sacchari）為國(guó)內(nèi)甘蔗梢腐病菌的優(yōu)勢(shì)種。目前國(guó)內(nèi)對(duì)甘蔗鐮刀菌的研究和報(bào)道較少，梢腐病的防治還沒(méi)有科學(xué)有效的解決辦法，通過(guò)梢腐病不同病原菌致病力進(jìn)行測(cè)定，對(duì)篩選高抗種質(zhì)資源和選育病害高抗優(yōu)良新品種具有重要的科學(xué)意義。

我國(guó)對(duì)梢腐病的抗性研究不多，主要集中在田間的抗性評(píng)價(jià)［2，3，17，18］。上個(gè)世紀(jì)90年代，劉夢(mèng)林等［3］最早開始對(duì)甘蔗梢腐病的抗性展開了一些研究，并初步制定了一些抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。林善海研究團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上建立了甘蔗梢腐病田間抗性評(píng)價(jià)體系，明確了不同甘蔗種植區(qū)域、不同品種（系）以及不同種植時(shí)期存在感抗梢腐病差異性［2］。并對(duì)廣西蔗區(qū)主要栽種的13個(gè)推廣品種進(jìn)行了田間抗性評(píng)價(jià)，其中2個(gè)中抗梢腐病品種、9個(gè)抗梢腐病品種、2個(gè)高抗梢腐病品種［18］。李文鳳等［19］根據(jù)發(fā)病株率劃分5個(gè)等級(jí)，并對(duì)甘蔗新良種及主栽品種進(jìn)行自然抗性評(píng)價(jià)。Wang等［20］對(duì)88個(gè)甘蔗材料采用注射接種法進(jìn)行梢腐病抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GT37和GT21為感梢腐病材料，ROC22和YT94-128為抗梢腐病材料。植物病害的發(fā)生除了自身的抗性，還與環(huán)境條件、病原種群和密度、栽培措施等因素密切相關(guān)，采用人工脅迫接種能最大限度反應(yīng)植物本身的抗病性。本課題組前期以F. sacchari為接種體，采用室內(nèi)離體接種方法結(jié)合病斑長(zhǎng)度，初步建立了室內(nèi)離體抗性評(píng)價(jià)方法［21］。本研究在前期基礎(chǔ)上擬采用離體葉片接種法，以多種甘蔗梢腐病病原菌為接種體，分析甘蔗對(duì)梢腐病菌的抗性，為進(jìn)一步研究梢腐病菌與甘蔗相互作用奠定基礎(chǔ)，并為篩選抗病種質(zhì)資源、甘蔗新品種選育和推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)甘蔗材料選用ROC22、GT37、LC05-136等3個(gè)栽培品種及F134、CP34-120、CP72-1210、CP85-1308、CP89-170和HoCP02-263等6份甘蔗種質(zhì)材料，其中3個(gè)栽培品種ROC22、GT37和LC05-136在廣西蔗區(qū)生產(chǎn)上對(duì)梢腐病的抗性分別表現(xiàn)為抗病、高感和高感（相對(duì)GT37稍輕一些）。蔗種剝?nèi)~砍種后于2019年4月10日種植在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所大棚內(nèi)。利用野生菌株甘蔗鐮刀菌（F. sacchari）PB4-21和PB6-3菌株、新知鐮刀菌（F. andiyazi）PB3-1菌株、層出鐮刀菌（F. proliferatum）NN2菌株以及PB6-3 和PB3-1 的EMS 誘 變 菌 株（MPB6-3 和MPB3-1）共計(jì)6份材料作為接種體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種體準(zhǔn)備

將保存于-80℃的梢腐病菌野生菌株P(guān)B3-1、PB6-3、PB4-21、NN2及2個(gè)EMS誘變菌株MPB6-3和MPB3-1菌液中吸取20μL菌液于20mL馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDW）中，30℃、220rpm搖菌2d左右，待菌絲長(zhǎng)出后進(jìn)行二次活化，從活化的菌液中吸取20μL滴加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）表面，采用涂布法，將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)皿表面，封口膜封口，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3d，接種前用打孔器將平板打成9mm的菌餅用于室內(nèi)離體接種。

1.2.2 室內(nèi)離體接種

參照孫潔瑩等人［22］的離體葉片接種方法，分別于7月8日（分蘗期）和9月23日（伸長(zhǎng)期）用菌株進(jìn)行接種，剪取10份不同甘蔗材料+2～+3葉健康葉片于室內(nèi)進(jìn)行針刺接種，每個(gè)材料3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3張葉片。先用75%酒精將甘蔗葉片擦凈，將每張葉片剪成13cm左右片段，葉片兩端用酒精進(jìn)行消毒防止傷口感染，在葉脈中間一側(cè)進(jìn)行針刺處理，將長(zhǎng)有菌絲一面的菌餅覆蓋在傷口處，每片葉接種1塊菌餅，處理好的甘蔗葉片放置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中放一張濕潤(rùn)濾紙對(duì)葉片進(jìn)行保濕，室溫下培養(yǎng)（濕度80%～90%），跟蹤觀察病斑發(fā)展情況。

1.2.3 病情調(diào)查和抗性評(píng)價(jià)

根據(jù)前期的研究結(jié)果［21］，選擇在接種后第7d測(cè)量病斑的長(zhǎng)度，沿著葉脈方向測(cè)量黃色暈圈的長(zhǎng)度，根據(jù)病斑長(zhǎng)度劃分梢腐病發(fā)病等級(jí)和抗性等級(jí)，結(jié)果見表1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)病斑長(zhǎng)度，利用Excel 2007對(duì)接種發(fā)病的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株致病力測(cè)定

測(cè)試的3個(gè)Fusarium種5個(gè)菌株均可引起測(cè)試的9份甘蔗材料發(fā)病。菌株P(guān)B3-1能夠較快識(shí)別并侵入甘蔗葉引起發(fā)病，除了在ROC22和CP72-1210品種上較NN2菌株快外，后期病斑的拓展上相對(duì)較其他菌株弱。5個(gè)菌株對(duì)甘蔗CP85-1308品種致病力較弱，對(duì)F134和CP72-1210兩個(gè)甘蔗品種致病力較強(qiáng)，接種第7d所有的材料病斑直徑均超過(guò)100mm，結(jié)果見表2。

表1 甘蔗梢腐病室內(nèi)接種發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 誘變菌株和野生菌株致病力測(cè)定

采用F. andiyazi和F. sacchari的兩個(gè)野生菌株（PB3-1和PB6-3）與誘變菌株（MPB3-1和MPB6-3）對(duì)9份甘蔗材料進(jìn)行致病力比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘變菌株致病力整體上明顯變?nèi)?，但在個(gè)別甘蔗材料上結(jié)果相反，F(xiàn). andiyazi誘變菌株MPB3-1對(duì)甘蔗材料ROC22、HoCP02-263和CP72-1210及F. sacchari誘變菌株MPB6-3對(duì)甘蔗材料F134、CP34-120、CP72-1210、LC05-136和CP89-170的致病力均較野生菌株強(qiáng)，結(jié)果見表3。說(shuō)明誘變后，菌株的部分致病力基因發(fā)生變異，但菌株的致病力是由多個(gè)基因共同作用，且不同甘蔗品種對(duì)病原的不同致病基因響應(yīng)效果不同。

表2 不同甘蔗梢腐病菌對(duì)甘蔗種質(zhì)材料離體接種結(jié)果

2.3 不同甘蔗材料對(duì)不同菌株抗性評(píng)價(jià)

供試的9個(gè)甘蔗種質(zhì)材料中，甘蔗品種ROC22對(duì)3個(gè)Fusarium種4個(gè)菌株均表現(xiàn)為感病或高感，感病程度高于生產(chǎn)中的表現(xiàn)，可能由于人工接種與田間的感病機(jī)制存在較大差異。GT37對(duì)3個(gè)Fusarium種均表現(xiàn)為高感，與生產(chǎn)上的表現(xiàn)一致。LC05-136僅對(duì)F. sacchari PB6-3菌株表現(xiàn)為高感，但對(duì)相同種另外一個(gè)菌株P(guān)B4-21反而表現(xiàn)為中抗，說(shuō)明菌株致病力存在較大差異；另外，LC05-136對(duì)PB3-1和NN2表現(xiàn)為感病，感病情況與生產(chǎn)上的表現(xiàn)一致。CP85-1308對(duì)5個(gè)不同菌株抗病性最好，整體抗病性較好，F(xiàn)134和CP72-1210這2個(gè)甘蔗品種表現(xiàn)均為高感，整體抗病性較弱，結(jié)果見表4。

2.4 不同甘蔗材料對(duì)誘變菌株與野生菌株抗性評(píng)價(jià)

CP34-120和LC05-136分別對(duì)PB3-1和誘變菌株MPB3-1的抗性水平表現(xiàn)相同，ROC22、CP72-1210和HoCP02-263對(duì)野生菌株P(guān)B3-1抗性水平較誘變菌株MPB3-1強(qiáng)，其余4個(gè)品種則相反。ROC22和CP72-1210分別對(duì)PB6-3和誘變菌株MPB6-3的抗性水 平 也 表 現(xiàn) 相 同，LC05-136、F134、CP34-120 和CP89-170對(duì)野生菌株P(guān)B6-3的抗性水平較誘變菌株MPB6-3強(qiáng)，其余3個(gè)品種則相反，結(jié)果見表5。

表3 誘變菌株和野生菌株對(duì)人工接種致病力測(cè)定

表4 不同甘蔗材料對(duì)不同菌株抗性評(píng)價(jià)

2.5 不同接種時(shí)期致病力比較

綜合兩個(gè)甘蔗生長(zhǎng)期葉片發(fā)病的測(cè)定結(jié)果，除PB3-1接種CP85-1308伸長(zhǎng)期較分蘗期發(fā)病情況較重，PB3-1 接 種F134，PB6-3 接 種ROC22、CP85-1308，MPB6-3接種ROC22、CP34-120和CP85-1308發(fā)病情況相同外，整體上甘蔗品種伸長(zhǎng)期整體接種情況較分蘗期發(fā)病較輕，甘蔗病原菌在分蘗期致病力較強(qiáng)，伸長(zhǎng)期致病力較弱，結(jié)果見表6。

3 討論

甘蔗品種的抗病性受到區(qū)域性氣候、生態(tài)環(huán)境、栽培方式和病原種群等因素的影響，而同一品種對(duì)梢腐病不同病原的抗性也不同［20］。本研究結(jié)果表明，不同病原菌對(duì)甘蔗的致病力存在明顯差異。部分菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果不同，可能是由于甘蔗不同生育期導(dǎo)致的差異。整體結(jié)果與前人的田間抗性調(diào)查結(jié)果略有差異，前人［17-18］研究表明，ROC22田間表現(xiàn)為抗病，但在本實(shí)驗(yàn)中整體表現(xiàn)為中感或高感，說(shuō)明其他因素對(duì)ROC22的抗病性起到了主導(dǎo)作用。LC05-136田間表現(xiàn)高感，但在本研究中對(duì)F. sacchari強(qiáng)致病力PB6-3菌株表現(xiàn)為高感，對(duì)弱致病力F. sacchari PB4-21菌株表現(xiàn)為中抗，而對(duì)F. proliferatum和F. andiyazi表現(xiàn)為感病，說(shuō)明田間引起LC05-136梢腐病嚴(yán)重發(fā)生時(shí)的病原很可能是F. sacchari。GT37在生產(chǎn)中也是高感梢腐病的品種，在本研究結(jié)果中，均對(duì)3個(gè)鐮刀菌種表現(xiàn)為高感，說(shuō)明田間引起GT37梢腐病嚴(yán)重發(fā)生的病原很可能是這3個(gè)鐮刀菌種中其中一個(gè)，或者多個(gè)符合侵染。PB6-3對(duì)LC05-136表現(xiàn)為強(qiáng)致病力菌株，PB4-21表現(xiàn)致病力較弱，但在GT37上的致病力恰好相反，說(shuō)明不同基因型甘蔗品種對(duì)同一個(gè)病原菌治病基因的響應(yīng)不同。CP72-1210在田間表現(xiàn)為中抗［23］，但在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)均為高感，可能由于不同菌株致病力不同導(dǎo)致，說(shuō)明不同病原菌對(duì)甘蔗的致病力存在明顯差異。甘蔗和病原菌在長(zhǎng)期的互作進(jìn)化中會(huì)發(fā)生變異而喪失抗病性，因此試驗(yàn)篩選出的高抗、中抗材料還應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)期和大面積的田間種植與調(diào)查，才能更系統(tǒng)全面的評(píng)價(jià)甘蔗品種的抗病性。

表5 不同甘蔗材料對(duì)EMS誘變菌株與野生菌株抗性評(píng)價(jià)

表6 不同生育期甘蔗材料對(duì)梢腐病菌的抗性比較

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變是最為有效的化學(xué)誘變技術(shù)方法之一，其能誘發(fā)產(chǎn)生高密度的系列等位基因點(diǎn)突變，具有誘變頻率高［24］、對(duì)材料損傷輕和成本低［25］等特點(diǎn)，被廣泛用于植物和微生物誘變育種中。Statler［26］和Teo等人［27］用EMS處理小麥稈銹菌、小麥葉銹菌和燕麥稈銹菌后，獲得了毒性不同、顏色變異和冬孢子發(fā)育速率不一的不同表型突變體。姚秋燕等人［28］在此基礎(chǔ)上研究了EMS誘導(dǎo)小麥條銹菌毒性突變，獲得了5個(gè)突變菌系，研究證實(shí)了小麥條銹病菌毒性突變是其毒性變異的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)采用F. andiyazi和F. sacchari的兩個(gè)野生菌株與誘變菌株對(duì)9份甘蔗材料進(jìn)行致病力比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘變菌株致病力整體上明顯變?nèi)酰趥€(gè)別甘蔗材料上結(jié)果相反。說(shuō)明誘變后，菌株的部分致病力基因發(fā)生變異，但菌株的致病力是由多個(gè)基因共同作用，而且不同甘蔗品種對(duì)病原的不同致病基因響應(yīng)效果不同。

綜合兩個(gè)時(shí)期發(fā)病的調(diào)查結(jié)果，9個(gè)甘蔗品種伸長(zhǎng)期整體發(fā)病較分蘗期輕。通過(guò)不同生育期接種試驗(yàn)對(duì)比可以看出，不同甘蔗材料對(duì)梢腐病的抗性不同，甘蔗的不同生長(zhǎng)時(shí)期抗病性也會(huì)發(fā)生變化。這可能與葉片的老嫩程度有關(guān)，分蘗期的葉片相對(duì)伸長(zhǎng)期的葉片嫩，葉片纖維化和木質(zhì)化程度也相對(duì)較低，易于病原菌的入侵，另外還可能與礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收及細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，其抗性差異機(jī)制有待深入研究。