陳潔

摘 要：黃芪作為一種經(jīng)典的中藥，在臨床中能夠起到補(bǔ)中益氣、利水消腫、斂汗固脫的功效。現(xiàn)代研究認(rèn)為其還有調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫力以及保護(hù)心肝的作用，在臨床中具有非常重要的藥用價(jià)值。很多中成藥中都含有黃芪，基于此，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定法對(duì)中藥黃芪中所含的異黃酮類(lèi)成分進(jìn)行測(cè)定。逐一對(duì)成品中的芒柄花素（F）、毛蕊異黃酮（C）以及黃芪異黃烷苷（A）進(jìn)行定性檢測(cè)，并對(duì)F和C的含量進(jìn)行了有效的測(cè)定，以期為臨床用藥提供安全保障。

關(guān)鍵詞：黃芪類(lèi);HPLC測(cè)定法;芒柄花素（F）;毛蕊異黃酮（C）

現(xiàn)階段，隨著我國(guó)對(duì)藥品安全的重視程度不斷提高，為了保障用藥安全，需要對(duì)藥品中的各種藥物成分及其含量進(jìn)行有效測(cè)定，確保其按照相應(yīng)的比例進(jìn)行配比，保障臨床用藥的安全。目前，對(duì)于黃芪質(zhì)量控制多選用黃芪甲苷作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，但檢測(cè)儀器需要蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，導(dǎo)致成本較高。運(yùn)用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定法對(duì)其中所含的異黃酮類(lèi)成分及含量進(jìn)行定性和定量的檢驗(yàn)，能夠有效提高黃芪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)告如下。

1 ? ?儀器、試劑以及樣品的準(zhǔn)備

整個(gè)測(cè)定過(guò)程所用的儀器為高效液相色譜儀、色譜柱，用到的試劑為無(wú)水乙醇、正庚烷溶劑，并保證所用試劑等級(jí)均為AR級(jí)。黃芪藥材均由實(shí)驗(yàn)室人員采集、收集和鑒定，并按照品種進(jìn)行分類(lèi)，分為蒙古黃芪（主要產(chǎn)地為山西、河北、內(nèi)蒙古）、莢膜黃芪（主要產(chǎn)地為四川、黑龍江）、多花黃芪（主要產(chǎn)地為甘肅、青海、西藏）以及金翼黃芪（主要產(chǎn)地為陜西、寧夏）。HPLC測(cè)定條件：層析柱YWG80-5 μm，流動(dòng)相：正庚烷-無(wú)水乙醇-水-乙酸乙酯（80.00∶20.00∶0.05∶0.05），流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（定性）或250 nm（定量）。

2 ? ?方法與結(jié)果

2.1 ?運(yùn)用HPLC對(duì)黃芪中的異黃酮類(lèi)成分進(jìn)行定性測(cè)定

準(zhǔn)備黃芪細(xì)粉2 g，向其中加入30 mL乙醇溶液，將溶液充分混合，通過(guò)水浴回流對(duì)溶液進(jìn)行提取和過(guò)濾，并將得到的濾液放入蒸發(fā)皿中進(jìn)行水浴加熱蒸發(fā)，得到殘留物。向殘留物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的氫氧化鈉溶液10 mL進(jìn)行充分溶解，而后過(guò)濾。用稀鹽酸將濾液的pH調(diào)整為5～6。再將溶液分配到分液漏斗中，并用20 mL的乙酸乙酯溶液對(duì)其進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯層，用無(wú)水硫酸鈉對(duì)溶液進(jìn)行脫水處理，繼而過(guò)濾。利用1 mL的乙酸乙酯溶液溶解得到濾液，進(jìn)而得到測(cè)定試樣溶液[1-2]。

先通過(guò)F、C以及A的對(duì)照品溶液進(jìn)行樣品的層析，將檢測(cè)儀器的波長(zhǎng)定為280 nm，其他HPLC測(cè)定條件不變。分別取上述過(guò)程中的溶液1～2 μL進(jìn)行層析，發(fā)現(xiàn)試液中已經(jīng)包含了這3種異黃酮成分，在所檢測(cè)的10種試樣中，均能檢測(cè)出F、C、A成分的存在。

2.2 ?運(yùn)用HPLC對(duì)黃芪中的異黃酮類(lèi)成分F、C進(jìn)行定量測(cè)定

2.2.1 ?檢測(cè)色譜條件

根據(jù)F、C對(duì)紫外線（UV）光譜的最大吸收量，確定其波長(zhǎng)為250 nm。流動(dòng)相：用不同配比的正庚烷-無(wú)水乙醇-水-乙酸乙酯等系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)被測(cè)定成分分析分離情況，確定最后配比為80.00∶20.00∶0.05∶0.05，保持水浴流速為1 mL/min，層析柱壓為90 kg/cm2。在此測(cè)定條件下，F(xiàn)的保留時(shí)間為5.23 min，C的保留時(shí)間為7.54 min。

2.2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量含有無(wú)水乙醇溶液的F與C（其中含有F 0.036 9 mg/mL，含有C 0.163 5 mg/mL）。并用微量注射器分別對(duì)1、2、3、4、5 μL相關(guān)溶液進(jìn)行層析，以峰高值作為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，繪制相關(guān)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出F的質(zhì)量在0.036 9～0.193 5 μg內(nèi)呈線性相關(guān)，C的質(zhì)量在0.163 5～0.832 1 μg內(nèi)呈線性相關(guān)，并得出回歸方程分別為：

F∶Y=142 7+808 6 X，r=0.993 5

C∶Y=﹣306+578 1 X，r=0.993 8

2.2.3 ?精密度

對(duì)上述溶液進(jìn)行5 μL進(jìn)樣，連續(xù)試驗(yàn)5次，能夠測(cè)得F的平均峰高為42 168，CV=1.67%;測(cè)得C的平均峰高為29 518，CV=0.86%。

2.2.4 ?具體的測(cè)定方法

精密稱(chēng)取黃芪細(xì)粉，取3 g放入索氏提取器中，加入 ? ? 90 mL無(wú)水乙醇溶液進(jìn)行過(guò)夜浸泡。通過(guò)水浴回流提取出無(wú)色的浸出液，整個(gè)水浴回流的過(guò)程將持續(xù)5 h，將得到的浸出液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，通過(guò)水浴加熱得到殘留物，并分別用 ?20 mL的乙醚和20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的鹽酸溶液進(jìn)行交替溶解，進(jìn)而將溶解液分別轉(zhuǎn)入分液漏斗中進(jìn)行分層并取乙醚層。得到的乙醚層再用10 mL的乙醚提取兩次，合并后的乙醚溶液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的氫氧化鈉溶液10 mL進(jìn)行3次提取，最后合并堿溶液，用稀鹽酸將溶液的pH調(diào)整為5～6后，分別用10 mL的乙醚溶液進(jìn)行4次提取，最后合并乙醚溶液，用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理，并通過(guò)過(guò)濾除去其中所含的乙醚，得到的殘留物再用2 mL的無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌和溶解，并將得到的溶液轉(zhuǎn)入容量為2 mL的容量瓶中，再加入無(wú)水乙醇至相關(guān)刻度搖勻，然后將其按照上述對(duì)HPLC測(cè)定條件的設(shè)置，進(jìn)行3 μL試樣層析測(cè)定，并用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)F、C進(jìn)行定量測(cè)定。

2.2.5 ?回收率的測(cè)定

運(yùn)用HPLC測(cè)定法測(cè)定2 g黃芪樣品的F和C含量，并精密稱(chēng)取對(duì)照樣品2 g，按照同種方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出回收率，結(jié)果為：F的回收率為97.36%，CV=4.61%;C的回收率為98.13%，CV=4.94%，n=3。

2.2.6 ?樣品測(cè)定結(jié)果

樣品測(cè)定結(jié)果如表1所示。

3 ? ?結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用HPLC測(cè)定法對(duì)黃芪類(lèi)藥物中的F、C、A進(jìn)行定性測(cè)量，并對(duì)其中的F和C進(jìn)行定量測(cè)量，測(cè)試過(guò)程靈敏度高、重現(xiàn)性好。同時(shí)，所用的流動(dòng)相系統(tǒng)以及樣品預(yù)處理方式簡(jiǎn)單、快捷，能夠?qū)S芪中所含的異黃酮成分進(jìn)行有效測(cè)定，為黃芪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了借鑒。鑒于黃芪中所含的異黃酮成分具有很好的溶解性，整個(gè)測(cè)試過(guò)程用乙醚溶液進(jìn)行提取，并考察了整個(gè)過(guò)程F和C的回收率。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是哪個(gè)產(chǎn)地的黃芪，經(jīng)過(guò)HPLC測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定后，都能得出其含有F、C以及A的結(jié)論，并且再對(duì)F和C進(jìn)行定量測(cè)量，能夠計(jì)算出10種樣品中F和C的含量，以便臨床使用時(shí)，根據(jù)具體要求選擇適合的黃芪類(lèi)藥物。

異黃酮類(lèi)物質(zhì)是黃芪類(lèi)藥物中的重要組成部分，在黃芪中占有很大的比例，且異黃酮類(lèi)物質(zhì)直接決定了黃芪類(lèi)藥物的藥理性質(zhì)，異黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的增加、異黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的下降，都將導(dǎo)致黃芪類(lèi)藥物質(zhì)量改變。因此，實(shí)驗(yàn)室需要運(yùn)用HPLC測(cè)定法對(duì)黃芪類(lèi)中異黃酮物質(zhì)進(jìn)行定性和定量測(cè)量，以此來(lái)保障黃芪的質(zhì)量。

[參考文獻(xiàn)]

[1]撒偉文，王寶琴.黃芪類(lèi)中藥中芒柄花素和毛蕊異黃酮的HPLC測(cè)定[J].中成藥，1991，13（9）：32-33.

[2]楊星辰，史秀峰，楊費(fèi)莉.高效液相色譜法考察黃芪蜜炙前后4種異黃酮含量的變化[J].中南藥學(xué)，2012（2）：15-18.

High performance liquid chromatography determination of Formononetins and Pistil isoflavones in Astragalus membranaceus

Chen Jie

（Nanjing Jinling Pharmaceutical Co. Ltd.， Jinling Pharmaceutical Factory， Nanjing 210038， China）

Abstract：As a classic Chinese medicine， Astragalus membranaceus can play the role of tonifying， promoting diuresis and detumescence， astringent and solid off. Modern studies suggest that it can also regulate blood pressure， enhance immunity and protect the heart and liver， which has very important medicinal value in clinic. Many Chinese patent medicines contain Astragalus. Based on this， the isoflavones in Astragalus were determined by high performance liquid chromatography. The quality of Formononetin（F）， Pistil isoflavones（C）and Astragaloside（A） in the finished product were detected one by one， and the contents of F and C were determined effectively， in order to provide safety guarantee for clinical medication.

Key words：Astragalus membranaceus; high performance liquid chromatography determination; Formononetin（F）; Pistil isoflavones（C）