巴桑德吉 次尼 旦增央金 邊巴頓珠 色珍

（西藏自治區(qū)藏醫(yī)院開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究所，西藏 拉薩 850000）

烏頭屬植物大部分為毛茛科植物，其藥材多含烏頭類生物堿類成分，主要為烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿等，上述這些成分即是它的有效成分又是毒性成分。川烏和草烏為毛茛科烏頭屬植物，收載于中國(guó)藥典，其總生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿）的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05%～0.15%，文獻(xiàn)報(bào)道人口服烏頭堿3mg～5mg 可致死。毛茛科烏頭屬較常用的藏藥材，有鐵棒棰、美麗烏頭、和船盔烏頭，其中鐵棒棰（榜那）《衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥第一冊(cè)》記載有大毒，使用須注意，而現(xiàn)代研究也表明其含雙酯型生物堿，如烏頭堿及次烏頭堿，而其他兩個(gè)品種是否含毒性成分在藏醫(yī)界存在一定疑問(wèn)。[1-4]因此文章通過(guò)現(xiàn)代檢測(cè)方法對(duì)美麗烏頭和船盔烏頭藥材進(jìn)行烏頭堿類雙酯型生物堿含量測(cè)定，檢測(cè)是否含上述烏頭類生物堿及其量是否達(dá)到中毒劑量，從而為臨床安全用藥，以及各藏藥廠購(gòu)買原材料提供可靠依據(jù)。

美麗烏頭為毛茛科植物美麗烏頭Aconitum pulchellum Hand.-Mazz.的根，生于海拔2200m～4500m的水溝邊、河灘、草甸或林間，分布于西藏拉薩、日喀則、山南、林芝等地。其功能主治為清熱解毒，主治食肉中毒，藥物中毒等各種中毒癥，虛熱勞損引起的熱癥，膽熱、喉病。[5]

船盔烏頭為毛茛科植物唐古特烏頭Axonitum tanguticum(Maxim)Stapf 和船盔烏頭Aconitum naviculare(Bruhl)Stapf 的干燥全草。夏末秋初花期連根采挖，除去雜質(zhì)，陰干。其功能主治為清熱解毒，生機(jī)收口，燥濕。用于傳染病引起的發(fā)熱，肝膽熱病，血癥，胃熱，瘍瘡，蛇蝎咬傷以及黃水病。[1]

1 儀器

Aglien1260 高效液相色譜儀；Auto science AS20500 BDT Ultrasonic Cleaner；四川優(yōu)普超純水機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-6000A（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；藥典篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）；萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；溶劑過(guò)濾器（津騰）。

2 試藥

水為超純水，甲醇、乙酸銨、冰乙酸、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水、乙腈、四氫呋喃等均為色譜純；對(duì)照品：批號(hào)110799-201608 新烏頭堿、批號(hào)110799-201610 烏頭堿、批號(hào)110799-201609 次烏頭堿，上述對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所；4 批樣品分別購(gòu)置日喀則、林芝、山南、門孜康藏醫(yī)院，均經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院次仁巴珠專家鑒定。

3 方法學(xué)考察及結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱:島津C18柱(250mm×4.6μm，5μm);流動(dòng)相:以乙腈-四氫呋喃(25:15)為流動(dòng)相A,以0.1mol·L-1醋酸銨溶液(每l00mL 加二冰乙酸0.5mL)為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫:35℃,流速:1.0mL·min-1，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng):235nm；理論塔板數(shù)按照烏頭堿峰計(jì)算不低于2000。

表1 梯度程序洗脫

3.2 溶劑的配置

3.2.1 混合對(duì)照品溶液制備。適量取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對(duì)照品，準(zhǔn)確稱定，加異丙醇和三氯甲烷等比例混合物，分別制成含新烏頭堿0.2188mg/mL、次烏頭堿0.22286mg/mL、烏頭堿0.126mg/mL 的混合溶液，既得。

3.2.2 空白溶液的制備。異丙醇-三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解。

3.2.3 樣品溶液的制備。分別取過(guò)藥典篩三號(hào)的美麗烏頭和船盔烏頭粉末約2g，準(zhǔn)確稱定，放到加蓋的錐形瓶中，然后倒入氨試液3mL，再倒入異丙醇和乙酸乙酯等比例混合溶液50mL，準(zhǔn)確稱定重量，超聲（功率250W，頻率35kHz；常溫）30min，取出常溫放冷，稱定重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液25mL，40 度以下減壓回收溶液至干，殘?jiān)鼫?zhǔn)確加入異丙醇和三氯甲烷等比例混合溶液3mL溶解，濾過(guò)，續(xù)濾液作為樣品溶液。

3.2.4 樣品中加入混合對(duì)照品溶液的制備。分別取過(guò)藥典三號(hào)篩的美麗烏頭、船盔烏頭藥材粉約2g，準(zhǔn)確稱定，于每份中精密加入3.2.1 制備的混合對(duì)照品溶液0.5ml，按3.2.4制備方法制備樣品加混合對(duì)照品溶液。

3.3 線性關(guān)系的考察

精密量取對(duì)照品混標(biāo)溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，分別置于10mL量瓶中，加三氯甲烷-異丙醇（1:1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得個(gè)6 不同濃度的混標(biāo)對(duì)照品溶液，分別取10μL 注入高效液相色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程：新烏頭堿y1=11717.05X+5.02469,r=0.99964(n=7)；次 烏 頭 堿y2=11794.11X+1.08746,r=0.99986(n=7)；烏 頭 堿 y3=11362.17X-0.492851，r=0.99969(n=7)。表明新烏頭堿在0.104～2.152ug、次烏頭堿在0.104～2.152ug、烏頭堿在0.005～1.26ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 液相色譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合溶液10ul，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，RSD%分別為：新烏頭堿RSD=1.84 % (n=6)、次烏頭堿RSD=3.15%(n=6)、烏頭堿RSD=1.83(n=6)，表明儀器精密度較好。

3.5 檢測(cè)限與定量限考察

最低檢測(cè)限分別為烏頭堿0.0030ug/ul、新烏頭堿0.0073ug/ul、次烏頭堿0.0015ug/ul。

定量限分別為烏頭堿0.0089 ug/ul、新烏頭0.023 ug/ul，次烏頭堿0.0082ug/ul。

3.6 樣品中含量的檢測(cè)

分別精密吸取3.2.1、3.2.2、3.2.3、3.2.4制備的溶液10μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算和檢測(cè)美麗烏頭、船盔烏頭藥材中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量。結(jié)果空白溶液無(wú)干擾，樣品溶液中未檢測(cè)到上述化學(xué)成分，樣品中加入混合對(duì)照品溶液的回收率均在95%以上，說(shuō)明如果樣品中有上述的烏頭類生物堿，該條件能提取和檢測(cè)出，并且提取方法對(duì)上述生物堿無(wú)損失。結(jié)果見(jiàn)色譜圖2、圖3和表1。

表2 四批榜那藥材中次烏頭堿的含量測(cè)定結(jié)果

圖2 空白、混標(biāo)、美麗烏頭樣品、美麗烏頭加標(biāo)溶液色譜圖譜

圖3 空白、混標(biāo)、船盔烏頭、船盔烏頭加標(biāo)溶液色譜圖譜

3.7 結(jié)果及討論

美麗烏頭和船盔烏頭藥材為毛茛科烏頭屬植物，而中藥“川烏”也是毛茛科烏頭屬植物，其烏頭類雙酯型生物堿即是它的有效成分也是其毒性成分，中國(guó)藥典規(guī)定其烏頭類總生物堿的限量為0.05%～0.15%，按照科屬相同，成分相似的觀點(diǎn)，對(duì)美麗烏頭和船盔烏頭進(jìn)行了烏頭類雙酯型生物堿的測(cè)定，結(jié)果上述兩個(gè)藥材的供試品溶液中未檢測(cè)到烏頭類雙酯型生物堿。供試品制備時(shí)加入新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿峰混標(biāo)溶液，其回收率均在95%以上，說(shuō)明如果美麗烏頭和船盔烏頭中有烏頭類雙酯型生物堿，該制備方法和色譜條件能檢測(cè)出，并且制備過(guò)程對(duì)上述烏頭類雙酯型生物堿無(wú)損失。船盔烏頭藥材的標(biāo)準(zhǔn)收錄于《衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)中，其功能主治為清熱解毒，生機(jī)收口，燥濕；美麗烏頭標(biāo)準(zhǔn)未收載，傳統(tǒng)文獻(xiàn)記載其功能主治為清熱解毒，主治食肉中毒、藥物中毒等各種中毒癥，虛熱勞損引起的熱癥、膽熱、喉病?，F(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道船盔烏頭藥材主要成分為異葉烏頭堿、大麥芽堿、塔拉烏頭胺，未報(bào)道其含烏頭類雙酯型生物堿烏；美麗烏頭藥材所含化學(xué)成分報(bào)道極少，僅有一篇報(bào)道其含有異葉烏頭堿［1-4］。結(jié)合上述的文獻(xiàn)及試驗(yàn)初步證明美麗烏頭和船盔烏頭中不含毒性較大的烏頭類雙酯型生物堿，為臨床安全用藥提供保證。