蔡鍶，黃鋼花

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000

性早熟是指女性在8歲前、男性在9歲前開始出現(xiàn)第二性征發(fā)育的疾病，根據(jù)是否啟動(dòng)下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)可分為中樞性性早熟(促性腺激素釋放激素依賴性性早熟，CPP)或外周性性早熟(非促性腺激素釋放激素依賴性性早熟，PPP)。目前，CPP的病因可分為器質(zhì)性病變及非器質(zhì)性病變兩大類，其中，不完全性(部分性)性早熟是CPP中的一種特殊類型，表現(xiàn)為孤立的性發(fā)育，如單純性乳房早發(fā)育、單純性陰毛早發(fā)育和單純性早初潮[1]。本研究中涉及的性早熟疾病主要包括CPP和PPP。

《中醫(yī)兒科臨床診療指南·性早熟(修訂)》2016年版[2]推薦知柏地黃丸為性早熟主證、兼證的主要治療方劑。目前，已有學(xué)者研究了知柏地黃丸治療性早熟的臨床療效[3]。張穗洪[4]采用知柏地黃丸化裁方治療特發(fā)性性早熟，能有效降低患兒的性激素水平，改善性早熟的癥狀；劉超等[5]研究發(fā)現(xiàn)，知柏地黃丸聯(lián)合亮丙瑞林治療女童CPP，可緩解患兒第二性征的發(fā)育且不良反應(yīng)少、安全性高；鄭憐玉等[6]發(fā)現(xiàn)，知柏地黃丸治療部分性性早熟，能夠降低其轉(zhuǎn)為CPP的發(fā)生率。然而，每項(xiàng)研究項(xiàng)目的樣本量均較少，普遍質(zhì)量偏低，尤其未采用盲法及分配隱藏，療程長(zhǎng)短不一，各項(xiàng)研究間異質(zhì)性較大，可能存在發(fā)表偏倚等問題[7]。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度進(jìn)行分析，通過尋找知柏地黃丸治療性早熟的靶基因，從分子水平推測(cè)其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 知柏地黃丸成分收集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索知柏地黃丸化學(xué)成分，并根據(jù)成分吸收、分布、代謝和排泄(ADME)參數(shù)[8]，選取口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18的成分作為活性成分，建立知柏地黃丸活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 知柏地黃丸、性早熟疾病相關(guān)靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)獲取

將從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到的知柏地黃丸靶點(diǎn)導(dǎo)出，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)矯正為統(tǒng)一官方基因名稱。以“precocious puberty”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，https：//omim.org/)搜索性早熟疾病相關(guān)基因。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過R軟件相互映射，取交集得到藥物-疾病的靶點(diǎn)基因。

1.3 成分-靶點(diǎn)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytospase 3.3.0(https：//cytoscape.org/)軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)表示成分和靶標(biāo)，分別用不同的顏色和不同的形狀的節(jié)點(diǎn)(node)代表所對(duì)應(yīng)的成分和作用靶點(diǎn)，邊(edge)表示節(jié)點(diǎn)相互作用關(guān)系，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖。利用Tool工具中Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，計(jì)算相關(guān)拓?fù)鋮?shù)如節(jié)點(diǎn)度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)，取度值和介數(shù)中心性綜合排名靠前的活性成分。

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(http：//stitch.embl.de)數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”項(xiàng)，物種選擇為“homo sapiens”，獲得蛋白相互作用關(guān)系，選取combined score置信度值≥0.9，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。導(dǎo)出文件，并通過R 3.6.2(https：//www.r-project.org/)軟件計(jì)算得到排名前10的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.4 靶點(diǎn)基因基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

以R軟件為平臺(tái)，運(yùn)用“ClusterProfiler”程序包，利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，物種和背景欄均選擇“homo sapiens”，分析結(jié)果包括GO功能分析和KEGG通路分析，以校正后的P<0.05為閾值，篩選顯著富集的生物功能和通路，獲得交集基因主要的生物功能和作用通路。

2 結(jié)果

2.1 知柏地黃丸活性成分及其治療性早熟靶點(diǎn)篩選結(jié)果

根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18原則，共篩選得到知柏地黃丸中113種活性成分。其中，熟地黃中2個(gè)、茯苓中15個(gè)、山茱萸中20個(gè)、澤瀉中10個(gè)、牡丹皮中11個(gè)、山藥中16個(gè)、知母中15個(gè)、黃柏中37個(gè)。依據(jù)DL水平列舉出前20種活性成分，見表1。篩選得到知柏地黃丸藥物靶點(diǎn)125個(gè)，與性早熟相關(guān)的疾病靶點(diǎn)1022個(gè)，取藥物與疾病靶點(diǎn)的交集，可得到70個(gè)靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 知柏地黃丸藥物靶點(diǎn)與性早熟疾病靶點(diǎn)韋恩圖

表1 知柏地黃丸部分活性成分

2.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的知柏地黃丸成分和其治療性早熟的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscope 3.3.0軟件，得到成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)共包含133個(gè)節(jié)點(diǎn)、276條邊，其中，63個(gè)節(jié)點(diǎn)代表知柏地黃丸有效成分，70個(gè)節(jié)點(diǎn)代表與有效成分相關(guān)的性早熟治療靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為4.120。節(jié)點(diǎn)的度值表示該節(jié)點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)相連的路線條目，度值越大代表該節(jié)點(diǎn)是連接其他節(jié)點(diǎn)的重要橋梁[9]。取節(jié)點(diǎn)度值和介數(shù)中心性綜合排名前5的化合物及排名前9的靶點(diǎn)，見表2～3。

表2 知柏地黃丸成分-性早熟靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的化合物

圖2 知柏地黃丸成分-性早熟靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將性早熟相關(guān)的靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，得到疾病PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共有61個(gè)節(jié)點(diǎn)和140條邊，網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為4.590，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，邊數(shù)越多表示該節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要，見圖3。結(jié)果表明，蛋白激酶B1(Akt1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、雌激素受體1(ESR1)、絲裂原活化的蛋白激酶14(MAPK14)、原癌基因c-Fos(FOS)、IL-1β、IL-4、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-10、IL-2度值較高，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶，見圖4。

圖3 性早熟疾病PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 性早熟疾病PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

通過GO注釋信息和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，得到校正后P<0.05的排名前20的生物學(xué)功能(核受體活性；轉(zhuǎn)錄因子活性、直接調(diào)控配體特異性的DNA序列結(jié)合；氧化還原酶活性、通過結(jié)合或還原氧分子作用于配對(duì)供體；類固醇激素受體活性；血紅素結(jié)合；四吡咯結(jié)合；類固醇結(jié)合；單加氧酶活性；氧化還原酶活性、通過結(jié)合或還原分子氧作用于成對(duì)供體，還原黃素或黃素蛋白作為一個(gè)供體，并結(jié)合一個(gè)氧原子；細(xì)胞因子受體結(jié)合；細(xì)胞因子活性；類固醇羥化酶活性；銨離子結(jié)合；生長(zhǎng)因子受體結(jié)合；兒茶酚胺結(jié)合；受體配體活性；磷酸酶結(jié)合；蛋白酶結(jié)合；多巴胺結(jié)合；激酶調(diào)節(jié)活性)，見圖5。

表3 知柏地黃丸成分-性早熟靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值排名前9的靶點(diǎn)

圖5 知柏地黃丸治療性早熟GO功能富集

KEGG通路富集取校正后P<0.05，得到7條通路，為色氨酸代謝信號(hào)通路，類固醇激素生物合成信號(hào)通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路，苯丙氨酸代謝信號(hào)通路，組氨酸代謝信號(hào)通路，酪氨酸代謝信號(hào)通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝信號(hào)通路，見圖6。

圖6 知柏地黃丸治療性早熟KEGG通路富集

3 討論

CPP的發(fā)病是由于HPGA功能提前啟動(dòng)。一旦HPGA功能啟動(dòng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)將解除對(duì)下丘腦的抑制，下丘腦發(fā)育成熟，并對(duì)性激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)的敏感性下降，促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌量增加，刺激垂體合成與釋放促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)[10]。FSH可促進(jìn)男孩睪丸曲細(xì)精管中精子的生成，或促進(jìn)女孩卵巢中卵泡的產(chǎn)生和發(fā)育，最終啟動(dòng)兒童的青春期發(fā)育。LH可刺激男孩的睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成并分泌睪酮，或觸發(fā)女孩排卵，并使排卵后的卵泡壁轉(zhuǎn)化為黃體和分泌孕酮。目前研究表明，CPP的發(fā)病與DLK1基因突變有關(guān)，正常的DLK1基因編碼前脂肪細(xì)胞因子1(Pref-1)，其主要抑制脂肪細(xì)胞分化，把脂肪儲(chǔ)存變?yōu)橥庵苤|(zhì)氧化。當(dāng)DLK1基因發(fā)生突變，血清中的DLK1蛋白水平降低，可產(chǎn)生1種新的介于生殖系統(tǒng)與代謝之間的抗脂肪代謝途徑，表現(xiàn)為生殖器官發(fā)育伴肥胖、糖耐量異?；?型糖尿病、高脂血癥[11]。已知當(dāng)瘦素達(dá)到生殖標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，會(huì)促進(jìn)青春期的啟動(dòng)，而瘦素是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)，主要是調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡[12]。因此，一部分肥胖、脂代謝異常的患兒可能會(huì)出現(xiàn)性早熟。

中醫(yī)認(rèn)為，性早熟的發(fā)病與腎的功能密切相關(guān)，其病機(jī)為相火旺盛，致陰虛火旺，治療當(dāng)以滋陰降火為法[13]，首選知柏地黃丸。知柏地黃丸出自《醫(yī)宗金鑒》，含有澤瀉、山茱萸、黃柏、熟地黃、牡丹皮、山藥、茯苓、知母8味中藥，其中澤瀉能夠清熱利便、引火下行，山茱萸具有補(bǔ)腎澀精之功效，黃柏具有清熱瀉火等功效，諸藥合用能夠填補(bǔ)腎陰、泄相火。

3.1 有效成分

本研究結(jié)果表明，槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等為知柏地黃丸中治療性早熟的主要有效成分。槲皮素、山柰素都屬黃酮類化合物，均為植物雌激素[14-15]。研究表明，槲皮素可抑制卵巢細(xì)胞基礎(chǔ)功能(增殖和凋亡、卵巢類固醇和肽激素的釋放)及其上游激素刺激因子FSH的激活反應(yīng)[14]。山柰素則在人體雌二醇(E2)水平偏高時(shí)通過抗E2發(fā)揮作用[15]。在肥胖的性早熟患兒中，胰島素抵抗可能干擾肝臟中性激素結(jié)合球蛋白的合成，導(dǎo)致E2失活的減少，外周組織會(huì)持續(xù)存在未對(duì)抗的E2[16]。E2水平與子宮、卵巢容積呈正相關(guān)，高水平的E2持續(xù)作用于骨骺生長(zhǎng)板，可促進(jìn)骨成熟[17]。山柰素還可抑制脂質(zhì)積累，增加脂肪細(xì)胞中脂肪酸氧化信號(hào)[18]。β-谷甾醇和豆甾醇都屬植物甾醇。研究表明，雄性大鼠的睪酮和雌性大鼠的E2等性激素水平因攝入β-谷甾醇而升高[19]。而對(duì)山羊的研究表明，β-谷甾醇對(duì)生殖能力的影響卻相反[20]。另外，β-谷甾醇一方面可增加脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，并在分化為前脂肪細(xì)胞時(shí)刺激脂肪生成，一方面還能誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的脂解[21]。豆甾醇比β-谷甾醇在減少脂肪生成上更有效[22]。脫水淫藿素是淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物，淫羊藿苷屬于黃酮類化合物。脫水淫羊藿素是一種有效的轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)抑制劑[23]。已知SREBPs涉及人體游離脂肪酸和膽固醇合成的全過程，在脂代謝的調(diào)節(jié)過程中有重要的作用[24]。因此，脫水淫藿素可通過抑制SREBPs調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能，改善血脂異常和胰島素抵抗。

3.2 作用靶點(diǎn)

通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)，得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)有前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶2(PTGS2)、PTGS1、β-2腎上腺素能受體(ADRB2)、孕酮受體(PGR)、雄激素受體(AR)、ESR1、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1(GABRA1)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)等。其中，PGR為孕酮受體，可調(diào)節(jié)許多下游靶基因的表達(dá)。孕酮、E2等類固醇激素通過PGR發(fā)揮對(duì)靶細(xì)胞的作用[25]。PGR也調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞從卵泡中成功釋放。研究表明，PGR的表達(dá)被抑制時(shí)，小鼠排卵率嚴(yán)重降低，卵母細(xì)胞被截留[26]。此外，孕酮對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的激活過程需要共調(diào)節(jié)因子參與其與PGR的結(jié)合。其中一種是共激活因子，起增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄的作用；另一種是共抑制因子，起抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的作用[25]。根據(jù)成分-靶點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)PGR為β-谷甾醇、谷甾醇、山柰素等成分的作用靶點(diǎn)。因此，β-谷甾醇、谷甾醇、山柰素等成分可能作為共抑制因子抑制PGR靶基因轉(zhuǎn)錄。已知，介導(dǎo)E2生理作用的雌激素受體(ER)有2種亞型，分別為ERα和ERβ，分別由ESR1和ESR2基因編碼[27]，與黃體形成過程有關(guān)。其中，女性ERα和ERβ主要分布于卵巢及乳房中，子宮中以ERα為主；男性ERα和ERβ主要分布于睪丸中，前列腺中以ERβ為主，ERα同時(shí)高表達(dá)于下丘腦、終紋床核與生殖調(diào)節(jié)有關(guān)的腦區(qū)[28]。性早熟的發(fā)病需要ER與相應(yīng)性激素結(jié)合活化而發(fā)揮作用，已知槲皮素、山柰素等植物雌激素有拮抗部分性激素的作用。因此，含有此類成分的知柏地黃丸可能通過拮抗E2的分泌，或抑制環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)對(duì)ER的介導(dǎo)作用，從而發(fā)揮治療性早熟的作用。另外，AR與PGR、ER同為類固醇激素受體，是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。雄激素通過和AR的結(jié)合調(diào)控男性生殖器官的發(fā)育及維持正常的性功能，并在女性生殖器官的發(fā)育及功能發(fā)揮中起重要的作用。若雄激素與AR結(jié)合后的信號(hào)失調(diào)，則可能擾亂正常的生殖系統(tǒng)發(fā)育[29]。因此，AR作為性腺受體在治療性早熟中發(fā)揮著傳遞信號(hào)的作用。結(jié)合GO功能富集結(jié)果可知，知柏地黃丸通過作用于PGR、ESR1、ESR2、AR等，影響機(jī)體的核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)控的特異性DNA序列結(jié)合、類固醇激素受體活性功能。另外，研究表明，GABRA1在哺乳動(dòng)物的初情期，其受體會(huì)達(dá)到峰值，并刺激下丘腦，使GnRH脈沖分泌加強(qiáng)，進(jìn)一步刺激促性腺激素分泌，最終導(dǎo)致卵泡發(fā)育和排卵[30]。因此，GABRA1作為主要靶點(diǎn)可能受到槲皮素、山柰素等植物雌激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。

NR3C1為糖皮質(zhì)激素受體α-D3亞型，NR3C1基因遺傳缺陷可致全身或局部對(duì)糖皮質(zhì)激素不敏感[31]。若血皮質(zhì)醇(CORT)減少，對(duì)HPGA的抑制作用會(huì)減弱，則促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)代償性分泌增多，促使孕酮及17-羥孕酮堆積并向雄激素合成途徑轉(zhuǎn)化，致睪酮、雄烯二酚等增多，部分患兒可出現(xiàn)發(fā)育早、骨齡超出年齡[32]。且部分性早熟患兒可出現(xiàn)肥胖，隨著肥胖的發(fā)展，CORT影響下丘腦的糖皮質(zhì)激素受體水平上升，因此，糖皮質(zhì)激素受體是代謝紊亂的中介[33]。研究發(fā)現(xiàn)，知柏地黃丸能提高腎上腺皮質(zhì)激素型腎陰虛大鼠的CORT水平，恢復(fù)腎上腺組織形態(tài)和細(xì)胞正常分泌功能[34]。ADRB2在能量消耗和脂類代謝方面有重要作用，并與肥胖有一定相關(guān)性[35]。知柏地黃丸中的小檗堿、豆甾醇等成分有糾正脂代謝異常的作用[22，36]，且作用靶點(diǎn)為ADRB2。綜上所述，知柏地黃丸通過糾正性早熟患兒體內(nèi)各種代謝功能異常而達(dá)到治療作用。

知柏地黃丸節(jié)點(diǎn)度值最高的作用靶點(diǎn)為PTGS1和PTGS2。PTGS1和PTGS2是前列腺素(PG)合成所必需的2個(gè)催化酶，PG則可刺激垂體前葉分泌LH和FSH[37]。PTGS2還可產(chǎn)生一些分子信號(hào)，誘導(dǎo)LH、FSH等與相應(yīng)受體結(jié)合[38]。根據(jù)成分-靶點(diǎn)圖，槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等成分均可作用于PTGS1和PTGS2。因此，知柏地黃丸可能通過作用PTGS1和PTGS2拮抗PG，從而影響垂體前葉對(duì)LH和FSH的分泌作用、性激素的釋放及其與受體結(jié)合等功能。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)是由單個(gè)蛋白之間通過相互作用構(gòu)成，表示參與生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程的各個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)了解蛋白之間的功能聯(lián)系有重要意義。已知Akt1、MAPK14、IL-6、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-2、EGF、FOS等為PPI網(wǎng)絡(luò)度值較高的蛋白。在PPI中，Akt1、MAPK14參與磷酸酶結(jié)合功能。Akt1為3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，主要調(diào)節(jié)代謝、增殖、細(xì)胞存活等過程[39]。已知，Akt1參與的磷酸酶結(jié)合功能是胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化作用所必需的，IGF1是前脂肪細(xì)胞存活、增殖和分化必不可少的介質(zhì)[40]。而PI3K則是脂肪細(xì)胞生物活性特定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制PI3K會(huì)顯著損害前脂肪細(xì)胞的分化[41]。因此，Akt1參與的磷酸酶結(jié)合與脂肪代謝相關(guān)。MAPK14主要參與調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞功能的活動(dòng)，包括卵丘卵母細(xì)胞(COC)的膨脹和類固醇激素的生成[42]。MAPK也是連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因表達(dá)之間的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶之一，其蛋白質(zhì)磷酸化是快速傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的重要途徑，也是快速調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界反應(yīng)的基礎(chǔ)[43]。因此，MAPK14通過磷酸酶結(jié)合發(fā)揮信號(hào)通路作用，在細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用[44]。IL-6、IL-1β、IL-1、IL-2均為細(xì)胞因子，GO富集提示，其主要參與細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、受體配體活性功能。其中，IL-6與瘦素在脂質(zhì)代謝和體質(zhì)量增加方面具有顯著的功能[45]。IL-1β則可參與骨細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)，在一定劑量下，對(duì)成骨細(xì)胞表型具有顯著拮抗作用[46]。另外，IL-1β和IL-6可協(xié)同刺激小鼠顱骨成骨細(xì)胞中前列腺素E2(PGE2)，從而促進(jìn)合成環(huán)加氧酶-2(COX-2)和酪氨酸激酶，為鼠成骨細(xì)胞中PTGS2表達(dá)的有效刺激因子[47]。IL-6、IL-1β與性早熟導(dǎo)致兒童骨齡提前、骨骺融合過早等臨床特征相關(guān)[48]。IL-1β還可通過參與蛋白酶合成、PG產(chǎn)生和顆粒細(xì)胞類固醇激素生成過程，進(jìn)而參與機(jī)體的排卵，并激活人體顆粒-葉黃素細(xì)胞中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和p38途徑，增加環(huán)狀單磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化來刺激孕酮的合成[49]。而IL-10則具有抑制炎癥反應(yīng)和抑制基因轉(zhuǎn)錄作用[50]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激活骨骼肌中IL-10信號(hào)，IL-10可通過糖異生途徑改善慢性高脂飲食的肥胖小鼠的葡萄糖代謝，改善胰島素抵抗[51]。細(xì)胞因子IL-2與IL2R結(jié)合后，能促進(jìn)各種亞型淋巴細(xì)胞活化。已知PI3K/Akt通路在T細(xì)胞活化和生長(zhǎng)的合成代謝管理中發(fā)揮作用[52]。因此，IL-2受體配體活性功能也參與了PI3K/Akt通路。FOS在骨骼細(xì)胞的形成和發(fā)育方面起著關(guān)鍵作用，其在骨組織中的表達(dá)受ADRB2、p38MAPK等多種因素調(diào)節(jié)[53]。被MAPK磷酸化后可改變其活性與穩(wěn)定性[54]。在KEGG通路中，F(xiàn)OS與作用靶點(diǎn)MAPK14間存在內(nèi)分泌阻力、MAPK信號(hào)通路等通路。EGF可直接影響卵巢內(nèi)分泌功能，表現(xiàn)為抑制E2合成分泌，促進(jìn)孕酮合成代謝，還可促進(jìn)垂體分泌FSH和LH[55]，還是促卵泡LH信號(hào)的關(guān)鍵傳遞子，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟至關(guān)重要[56]。在PPI中，EGF主要是與Akt1、IGF2通過PIK3/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路發(fā)生聯(lián)系。

3.4 KEGG通路

通過KEGG通路發(fā)現(xiàn)，知柏地黃丸的作用靶點(diǎn)主要富集于色氨酸代謝、類固醇激素生物合成等信號(hào)通路。已知色氨酸代謝作為細(xì)胞和組織溝通的一部分，其代謝的底物在免疫反應(yīng)和神經(jīng)傳遞等途徑中發(fā)揮作用[57]。而單胺類氧化酶A(MAOA)和單胺類氧化酶B(MAOB)在PPI中參與了色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，酪氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝6條通路。普遍認(rèn)為，單胺氧化酶與神經(jīng)變性、神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂相關(guān)，MAOA為5-羥色胺和腎上腺素的底物，并在腦內(nèi)分布在腎上腺素能神經(jīng)元，而MAOB分布在5-羥色胺能神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[58]。因此，MAOA和MAOB在KEGG通路上參與神經(jīng)遞質(zhì)代謝。已知知柏地黃丸治療性早熟的作用可能與抑制HPGA功能提前發(fā)動(dòng)有關(guān)，并抑制機(jī)體分泌雄激素、E2等類固醇激素參與第二性征發(fā)育[59]。在KEGG通路中，參與類固醇激素合成信號(hào)通路的有CYP3A4、CYP1A2、CYP1A1及CYP1B1，為細(xì)胞色素P450家族，能將性激素等類固醇激素氧化，參與類固醇代謝途徑[60]。而該通路上的醛酮還原酶1C3(AKR1C3)則減少E2、睪酮等類固醇激素和PG，并參與外源性生物轉(zhuǎn)化，影響增殖信號(hào)通路[61]。而參與類固醇合成功能的有PGR、ESR1、ESR2、AR等靶點(diǎn)，為知柏地黃丸主要的作用靶點(diǎn)。因此，考慮知柏地黃丸通過抑制該通路上的信號(hào)傳遞以達(dá)到治療性早熟的目的。

綜上所述，知柏地黃丸中的槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等主要活性成分作用于PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR、AR、ESR1、GABRA1、NR3C1等靶點(diǎn)和色氨酸代謝、類固醇激素生物合成等信號(hào)通路，在分子水平上綜合調(diào)控性早熟。