閆強(qiáng) 丁佩 張勤雪

摘要：從采集自我國(guó)6個(gè)?。ㄊ校┚哂懈Y狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株，進(jìn)一步通過離體葉片接種檢測(cè)獲得54株致病菌株。通過形態(tài)學(xué)和保守序列分析共鑒定出14種致病病原菌，其中尖孢鐮刀菌檢出率最高，首次檢測(cè)出群結(jié)腐霉可以侵染綠豆并引起根腐癥狀。對(duì)來自國(guó)內(nèi)外12個(gè)綠豆品種進(jìn)行群結(jié)腐霉接種試驗(yàn)，結(jié)果表明，群結(jié)腐霉對(duì)不同綠豆品種均表現(xiàn)出強(qiáng)致病力，病情指數(shù)在45～96之間;進(jìn)一步分析表明，皖綠2號(hào)對(duì)群結(jié)腐霉表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抗性水平。

關(guān)鍵詞：綠豆;根腐病;病原菌分離;群結(jié)腐霉;抗病性;致病力

綠豆由于其生育期短、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，在用地養(yǎng)地及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要作用。同時(shí)綠豆是我國(guó)傳統(tǒng)的雜糧作物，因其經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值高，屬高蛋白、低脂肪、中淀粉、醫(yī)食同源作物，是人們理想的營(yíng)養(yǎng)保健食品。2016年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《全國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整規(guī)劃（2016—2020）》為我國(guó)雜糧小品種發(fā)展成為大產(chǎn)業(yè)、帶動(dòng)農(nóng)民增收指明了方向。2017年的“中央一號(hào)”文件也明確提出，增加我國(guó)雜糧等優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品供給。在政策導(dǎo)向、種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及人們飲食觀念改變的影響下，綠豆種植面積也在逐年增加，目前，我國(guó)綠豆常年種植面積超過66.67萬hm2（http：//www.moa.gov.cn/）。隨著我國(guó)綠豆種植面積的擴(kuò)大、重茬和迎茬，綠豆病蟲害也隨之逐漸加劇，進(jìn)而嚴(yán)重影響了綠豆產(chǎn)量和品質(zhì)。

綠豆生育期主要病害有苗期的根腐病，花莢期的枯萎病、葉斑病、病毒病、白粉病等。其中綠豆根腐病是一種由多種病原菌混合感染引起的土傳病害，病害發(fā)生在種子萌發(fā)后整個(gè)生育階段[1-2]。2014—2015年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在黑龍江西部地區(qū)綠豆種植區(qū)根腐病發(fā)病普遍[3]，給綠豆生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害。

本研究利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)綠豆根腐病致病菌進(jìn)行分離、鑒定，以期為后續(xù)研究該病害的發(fā)生規(guī)律、制定綜合防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集和病原菌分離純化

2019年7—9月，在國(guó)家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究人員幫助下，分別從位于河北省石家莊市、黑龍江省齊齊哈爾市、重慶市潼南縣、遼寧省沈陽(yáng)市、河南省南陽(yáng)市和內(nèi)蒙古呼和浩特市的綠豆種植田塊采集植株矮小，莖基部表現(xiàn)細(xì)縮，出現(xiàn)水漬、腐爛癥狀、褐色病斑的發(fā)病植株。

田間采集到的新鮮病株用自來水沖洗干凈，并用手術(shù)刀在莖基部的病健交界處切取大小約 0.5 cm×0.5 cm的組織小塊。組織樣本放入70%乙醇中處理30 s進(jìn)行表面消毒，然后移入2%次氯酸鈉溶液中處理10 min，最后以滅菌水沖洗5～7遍并用滅菌濾紙吸干組織表面水分。處理好的組織放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，然后在溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待有菌落長(zhǎng)出取邊緣菌絲純化2次后接種于PDA培養(yǎng)基斜面上保存。

1.2 致病性測(cè)定

從生長(zhǎng)3周的綠豆蘇綠1號(hào)植株上選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的三出復(fù)葉，切下后正面朝上置于保濕托盤中，葉柄處用濕潤(rùn)脫脂棉球包裹用于保濕。葉片中心位置區(qū)域用0.05%吐溫溶液處理，消除葉片表面張力，用滅菌水沖洗后再用1mL注射器在處理區(qū)域中心位置針刺創(chuàng)傷。從培養(yǎng)4 d的菌落邊緣切取大小約4 mm×4 mm的菌絲塊，貼在上述葉片創(chuàng)傷處。每個(gè)分離菌株接種10張葉片。接種完畢后用保鮮膜密封保濕，置于溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次葉片發(fā)病狀況。待接種葉片發(fā)病后，根據(jù)柯赫氏法則（Koch postulates）對(duì)病原菌進(jìn)行再分離。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，記錄菌落顏色和形態(tài)特征并拍照。挑取邊緣菌絲制作臨時(shí)切片，在光學(xué)顯微鏡（Olympus CX41）下觀察病原菌形態(tài)特征，結(jié)合菌落在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)和顏色特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》判定病原菌種類。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

從培養(yǎng)7 d的PDA平板表面刮取病原菌菌絲，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取病原菌總DNA[4]。分別采用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4，β-tubulin（TUBUF2_F/TUBUF1_R），Histone 3（H3-1a/H3-1b），EF1α（EF1-728F/EF1-986R）（表1）對(duì)病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小正確后送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast同源比對(duì)，與已報(bào)道病原菌的核酸序列進(jìn)行比較，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果確定病原菌種類。

1.5 群結(jié)腐霉菌接種物制備

分離得到的群結(jié)腐霉菌（Pythium myriotylum）菌株CQ19-1（PmCQ19-1）首先在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)4 d。接種體制備參照Kirkpatrick等的方法略加改動(dòng)：從邊緣切取約1 cm×1 cm大小的菌絲塊，放置10個(gè)菌絲塊到含有滅菌細(xì)沙-玉米粉培養(yǎng)基（200 mL細(xì)沙，11.2 mL玉米粉，80 mL滅菌水）的500 mL三角瓶中，然后置于溫度為25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，期間每天搖勻培養(yǎng)基以保證菌絲在培養(yǎng)基中分布均勻。收集培養(yǎng)物與蛭石按1 ∶ 4體積比混勻作為接種物備用[5]。

1.6 群結(jié)腐霉菌接種

綠豆接種參照Kirkpatrick等的方法：取250 mL一次性塑料杯底部打孔排水，裝入約150 mL蛭石，然后平鋪厚度為1 cm（約40 mL）的群結(jié)腐霉菌培養(yǎng)物[5-6]。挑選籽粒飽滿的綠豆種子每盆放置10粒于菌絲培養(yǎng)物表面，然后覆蓋50 mL蛭石。未培養(yǎng)菌絲的細(xì)沙-玉米粉培養(yǎng)基按同樣比例混合后作為空白對(duì)照，每個(gè)品種接種3盆。澆水至蛭石飽和后，放置于25 ℃、16 h—8 h光照—黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)期間及時(shí)澆水保證蛭石處于水分飽和狀態(tài)。

1.7 不同綠豆品種對(duì)群結(jié)腐霉菌的抗性評(píng)價(jià)

抗病表型數(shù)據(jù)記錄采用以下方案：分別于播種后7、14 d統(tǒng)計(jì)植株存活率;并于14 d小心拔出植株，用自來水沖洗干凈根部蛭石，記錄不同綠豆品種的發(fā)病等級(jí)。發(fā)病分級(jí)按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：（1）整個(gè)根系生長(zhǎng)健康，無發(fā)病癥狀;（2）側(cè)根可見輕微腐爛癥狀，1%～20%的根系組織表現(xiàn)出癥狀;（3）側(cè)根腐爛癥狀明顯，同時(shí)主根開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，21%～75%的根系組織表現(xiàn)出癥狀;（4）主根及側(cè)根均出現(xiàn)明顯腐爛癥狀，76%～100%的根系組織腐爛;（5）種子腐爛不萌發(fā)[6]。病情指數(shù)按以下公式計(jì)算：

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×發(fā)病等級(jí)數(shù)值）/（植株總數(shù)×最高發(fā)病等級(jí)數(shù)值）×100。

不同品種間抗病水平差異顯著性分析采用Fisher氏最小顯著差數(shù)檢驗(yàn)（LSD）法進(jìn)行多重比較，顯著水平以P<0.05為基準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣采集和病原菌分離

從來自6個(gè)?。ㄊ校┚哂懈Y狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株（表2、圖1）。其中河北省石家莊市5株、黑龍江省齊齊哈爾市22株、重慶市潼南縣18株、遼寧省沈陽(yáng)市14株、河南河南陽(yáng)市6株、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市8株。

2.2 病原菌致病性檢測(cè)和形態(tài)學(xué)特征

將分離得到的菌株分別接種綠豆離體葉片后，有54株分離物接種的葉片表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。不同致病菌侵染綠豆葉片后病斑表型和侵染時(shí)間表現(xiàn)出明顯差異，發(fā)病癥狀出現(xiàn)在接種后1～6 d，其中分離物CQ19-01C和HNS19-02在侵染24 h后即出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，侵染菌絲塊附近葉片出現(xiàn)明顯的水漬狀腐爛;而LN19-04a和LN19-04d在接種6 d后出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀（圖2）。收集發(fā)病組織樣本對(duì)病原菌進(jìn)行再分離，均獲得與接種分離物菌落形態(tài)一致的培養(yǎng)物，即完成柯赫氏法則（KochsPostulates）致病性檢測(cè)。

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落形態(tài)也表現(xiàn)出差異（圖3）。其中檢出率最高的1種病原菌生長(zhǎng)狀態(tài)如下：氣生菌絲濃密，絨狀，初期菌絲白色，后期菌落背面殘生淺紫色至深紫色色素（HLJ19-03b和NMGS19-02）。培養(yǎng)7 d后的菌落多產(chǎn)生小型分生孢子，卵圓或腎形，大小為（7～26）μm（平均值為12.0 μm）×（2～6）μm（平均值為4.2 μm），可初步判定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和另外3個(gè)基因保守區(qū)段序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果表明，54株致病菌共包含14種病原微生物。其中有16株是尖孢鐮刀菌，主要檢出地為齊齊哈爾市（7株）、呼和浩特市（5株）、南陽(yáng)市（4株）;10株是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），主要檢出地為齊齊哈爾市（4株）、石家莊市（3株）和南陽(yáng)市（3株）;其次是群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）（4株），檢出地為潼南縣（2株）、南陽(yáng)市（2株）;此外還從齊齊哈爾市檢出4株木賊鐮刀菌（F. equiseti）（表3）。

從地域分布來看，在沈陽(yáng)市的發(fā)病樣本分離到樹棲交鏈孢菌（Alternaria arborescens）、細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）、茄病鐮刀菌（F. solani）、螺旋木霉（Trichoderma spirale）和玉蜀黍絲核菌（Waitea circinata）等5種病原菌。在齊齊哈爾市的樣本中分離到厚孢鐮孢菌（F. chlamydosporum）、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌（F. proliferatum）等4種鐮刀菌和1種立枯絲核菌共5種病原菌。從來自南陽(yáng)市的樣本中分離到立枯絲核菌、群結(jié)腐霉、尖孢鐮刀菌和Fusarium neocosmosporiellum共4種病原菌。從來自潼南縣的樣本中分離出菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）、群結(jié)腐霉菌等3種致病菌。從來自呼和浩特市和石家莊市的樣本中分別檢出尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌（表3）。

2.4 群結(jié)腐霉形態(tài)學(xué)特征觀察

分析鑒定結(jié)果和侵染試驗(yàn)結(jié)果表明，群結(jié)腐霉為首次報(bào)道能夠侵染綠豆;同時(shí)對(duì)綠豆具有強(qiáng)致病性，接種離體葉片24 h后即出現(xiàn)明顯壞死斑，因此對(duì)該病原菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后，群結(jié)腐霉菌絲發(fā)達(dá)，呈棉絮狀，分枝，菌絲直徑為3～11 μm（平均值為7.2 μm）;孢子囊頂生或間生寬度為9～18 μm（平均值為13 μm）;藏卵器球形或近球形，直徑為23～35 μm（平均值為29.4 μm）;游動(dòng)孢子腎形，雙鞭毛（圖4）。

2.5 不同綠豆品種對(duì)群結(jié)腐霉抗病性評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)群結(jié)腐霉對(duì)不同綠豆品種的致病性并為后期抗源篩選提供參考，選擇了來自11個(gè)不同省份和1個(gè)巴基斯坦的共12個(gè)綠豆品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。播種后7、14 d存活率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同品種間存在明顯的抗性差異。蘇綠3號(hào)在2個(gè)調(diào)查時(shí)間點(diǎn)的存活率僅有13%、20%，而皖綠2號(hào)存活率分別為90%、93%，同時(shí)冀綠7號(hào)也表現(xiàn)出較高的存活率。病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與存活率

趨勢(shì)基本一致，12個(gè)品種的病情指數(shù)在45～96之間。皖綠2號(hào)在所檢測(cè)品種中表現(xiàn)出最強(qiáng)抗性，病情指數(shù)為45，顯著低于其他品種。需要注意的是，在所選擇的12個(gè)品種中，僅有皖綠2號(hào)的病情指數(shù)在50以下，其中有5個(gè)品種的病情指數(shù)都在90以上（圖5至圖7）。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)采集自我國(guó)6個(gè)?。ㄊ校┑母Y狀綠豆病株進(jìn)行病原菌分離，結(jié)合進(jìn)一步致病性檢測(cè)獲得了54株致病菌株，形態(tài)學(xué)和保守序列分析結(jié)果表明，其屬于14種病原微生物。目前，關(guān)于綠豆根部病害的研究相對(duì)于其他大宗作物還較落后，而抗病資源和基因的挖掘則研究更少。孫菲菲對(duì)多個(gè)省份綠豆3種主要土傳病害的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，其中也分離鑒定到大量尖孢鐮刀菌菌株[7]。本研究的結(jié)果與此類似，54株中有16株是尖孢鐮刀菌，此外還有另外13株分離物屬于鐮刀菌屬。本研究對(duì)每個(gè)地區(qū)采集樣本的分離病原菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)沈陽(yáng)市和齊齊哈爾市檢出病原菌種類最多，而呼和浩特市和石家莊市均只檢出1種病原菌，這些信息為綠豆種植者有針對(duì)性地進(jìn)行病害防治提供了相關(guān)參考。

此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)群結(jié)腐霉可以侵染綠豆并具有強(qiáng)致病性。群結(jié)腐霉隸屬于卵菌綱腐霉屬，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，其中許多種類是重要的土傳植物病原菌，常造成果實(shí)腐爛、根腐、莖基腐和幼苗猝倒病等多種作物病害[8]。群結(jié)腐霉作為一種土傳植物病原菌，可造成菜豆出苗前爛種和幼苗根腐[9];其引起的花生腐霉菌果腐病在一般發(fā)病田可造成產(chǎn)量損失達(dá)15%左右，重病田可致絕收[10];在黃姜上引起的莖基腐病造成的減產(chǎn)在 5%～30%之間[11];其引發(fā)的芋頭根腐病可造成 80%～100%的產(chǎn)量損失[12]。相關(guān)研究表明，在淹水和高濕的大豆田塊中，腐霉菌是最主要的土傳病原菌[5]。本研究對(duì)12份國(guó)內(nèi)外綠豆品種抗性評(píng)價(jià)的結(jié)果也顯示，群結(jié)腐霉對(duì)綠豆具有很強(qiáng)的致病性，僅有皖綠2號(hào)的病情指數(shù)在50以下，其中有5個(gè)品種的病情指數(shù)在90以上。因此在我國(guó)南方或雨水較多的年份應(yīng)該注意田間排水并采取積極措施，防止群結(jié)腐霉的危害。

目前，對(duì)作物根腐病主要通過應(yīng)用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，然而對(duì)群結(jié)腐霉等卵菌來講，它們不同于真菌，常見的真菌殺菌劑對(duì)其作用有限，作為土傳病原菌，在濕潤(rùn)條件下使用化學(xué)藥劑較為困難，成本昂貴，而且長(zhǎng)期使用殺菌劑會(huì)造成土壤污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性、以及危害其他土壤有益生物[13]。因此，利用植物遺傳抗性仍然是控制根腐病的一種有效方式。本研究對(duì)綠豆的群結(jié)腐霉抗性評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)進(jìn)行了積極探索，為后續(xù)的抗病資源篩選積累了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 薇，臺(tái)蓮梅，郭永霞，等. 防治綠豆根腐病藥劑篩選[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，28（4）：9-11，40.

[2]曲田麗，辛惠普，李健強(qiáng). 7 種殺菌劑對(duì)綠豆根腐病菌的毒力測(cè)定及增效混劑配比篩選[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2011，31（7）：43-46.

[3]李季李. 黑龍江省西部地區(qū)雜糧生產(chǎn)情況及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力調(diào)查分析[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2015.

[4]Guo L D，Hyde K D，Liew E Y. Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences[J]. New Phytologist，2010，147（3）：617-630.

[5]Kirkpatrick M T，Rothrock C S，Rupe J C，et al. The effect of Pythium ultimum and soil flooding on two soybean cultivars[J]. Plant Disease，2006，90（5）：597-602.

[6]Klepadlo M，Balk C S，Vuong T D，et al. Molecular characterization of genomic regions for resistance to Pythium ultimum var. ultimum in the soybean cultivar Magellan[J]. Theoretical and Applied Genetics，2019，132（2）：405-417.

[7]孫菲菲. 三種綠豆土傳病害病原菌鑒定[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017.

[8]Kamoun S，F(xiàn)urzer O，Jones J D，et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology，2015，16（4）：413-434.

[9]Rossman D R，Rojas A，Jacobs J L，et al. Pathogenicity and virulence of soilborne oomycetes on Phaseolus vulgaris[J]. Plant Disease，2017，101（11）：1851-1859.

[10]于 靜，吳菊香，許曼琳，等. 防治花生腐霉果腐病的化學(xué)藥劑篩選[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2020，42（1）：121-126.

[11]龍艷艷，劉增亮，汪 茜，等. 廣西東南沿海生姜莖腐病病原菌鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（3）：584-589.

[12]Tchameni S N，Cotarle M，Ghinea I O，et al. Involvement of lytic enzymes and secondary metabolites produced by Trichoderma spp. in the biological control of Pythium myriotylum[J]. International Microbiology，2020，23（2）：179-188.

[13]Tambong J T，Hfte M. Phenazines are involved in biocontrol of Pythium myriotylum on cocoyam by Pseudomonas aeruginosa PNA1[J]. European Journal of Plant Pathology，2001，107（5）：511-521. 劉加紅，盤文政，呂亞瓊，等. 具有煙草根結(jié)線蟲防效的萬壽菊秸稈生物有機(jī)肥配方及田間防控研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（6）：92-98.