梁爽，劉歡歡，王婷婷,石路瑩,李燦宇

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450052）

0 引言

子宮腺肌?。ˋdenomyosis,AM）是指子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層，異位的子宮內(nèi)膜組織刺激局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致周圍肌纖維肥大和增生，形成彌漫性病變或局灶性病變的疾病[1]。絕大多數(shù)患者會有進行性加重的痛經(jīng)、月經(jīng)量增多、子宮增大，繼而引發(fā)不孕等癥狀，嚴重影響婦女的健康及生活質(zhì)量[2]。有研究表明，AM 患者痛經(jīng)的發(fā)生率為30.0%～77.8%，并且呈逐年上升，發(fā)病年齡以40 歲以上經(jīng)產(chǎn)婦多見[3]。目前AM 的病因及發(fā)病機制不清，但文獻報道血管生成在AM 內(nèi)膜異位定植、侵襲及異常增殖發(fā)揮重要的作用[4]。其中環(huán)氧合酶-2( cyclooxgenase -2，COX-2)、血管生成因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）促進子宮內(nèi)膜血管的形成[5,6]。半乳糖凝集素-3（Galectin-3）在疾病形成過程中與細胞的增殖、血管的生成有直接或間接的關(guān)系[7]。本研究檢測了AM 患者血清、組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達，旨在探究各因子在AM 發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與臨床特征的關(guān)系，同時也為疾病的治療提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年8 月至2017 年4 月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院因子宮腺肌病行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實的子宮腺肌病患者38 例作為病例組，分別取其在位、異位內(nèi)膜組織用于研究，選擇同時期因子宮肌瘤行腹腔鏡下子宮全切術(shù)手術(shù)治療且術(shù)后排除子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜異位癥的患者40 例為對照組，病例組年齡23～42 歲，平均（34.2±4.4）歲，對照組年齡23～42歲， 平均（31.9±5.7）歲。納入標準：育齡期女性，月經(jīng)周期規(guī)律，術(shù)前3 個月內(nèi)無激素類藥物應(yīng)用史。 排除標準：長期用藥史，合并內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等病史，合并高血壓、糖尿病等慢性病史，合并卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜異位癥等雌激素依賴性子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病病史。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，并且經(jīng)患者知情同意。

1.2 材料與方法

血清標本：所有患者在術(shù)前清晨空腹留取其外周靜脈血4mL 注入一次性試管中，全血樣品樣品經(jīng)離心機10000r/min離心20min，然后將血清吸取放置在1.5mL 的EP 管內(nèi)，密封放置在-80℃冰箱中保存待測。標本的收集及應(yīng)用過程中應(yīng)注意避免反復(fù)的凍融。

組織標本：術(shù)中取AM 患者異位、在位內(nèi)膜組織及對照組正常子宮在位內(nèi)膜組織立即放入10%的中性緩沖福爾馬林中固定24h，然后至我院病理科進行脫水、包埋形成蠟塊常溫保存待測。切片的厚度約3mm。

1.3 ELASA 檢測

血清中COX-2、 VEGF、 Galectin-3 的測定使用人 ELISA試劑盒（購自武漢伊萊瑞特生物技術(shù)股份有限公司），實驗操作流程嚴格按照說明書中步驟進行，同時設(shè)置空白對照孔及復(fù)孔。采用波長450nm 測量每孔吸光度，根據(jù)標準曲線的結(jié)果計算出各因子的表達水平。

1.4 免疫組化檢測

采用免疫組織化學(xué)SP 法測定AM 異位、在位內(nèi)膜組織與對照組內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達情況。實驗過程嚴格按照免疫組化試劑盒中提供的說明書進行，預(yù)實驗先確定各因子的工作濃度（稀釋后的一抗）：COX-2（1:50）、VEGF( 1: 100)、Galectin-3( 1:50) 。

1.5 免疫組化結(jié)果判定

用低倍和高倍鏡觀察切片，陽性細胞為鏡下組織細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞漿或細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒沉著，染色明顯高于背景。VEGF 陽性部位位于胞漿、COX-2 陽性部位位于包膜和胞漿、Galectin-3 陽性部位位于胞漿。免疫組化結(jié)果由兩位實驗人員獨立進行定量評分，在細胞密集區(qū)隨機選取五個高倍視野，計數(shù)300 個細胞。先計算出陽性染色細胞的百分數(shù)(陽性率)同時評分，小于5%計為0 分，5%-25%計為1 分，26%-50%計為2 分，51%-75%計為3 分，大于75%計為4 分；染色強度判斷：0 分為無著色，1 分為淺棕黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。免疫組化結(jié)果判斷釆用雙盲法。結(jié)果以半定量評分表示，每個標本按染色強度和陽性細胞百分比的乘積計算。最后將陽性率評分與強度評分相乘所得之積即為該組織的免疫組化最終評分。最終根據(jù)兩者的乘積將染色情況分為4 級，0 分為陰性（-）、1-4 分為弱陽性（+）、5-8 分為陽性（++）、9-12 分為強陽性（+++）。

1.6 痛經(jīng)、子宮大小及月經(jīng)量評估

所有納入標準的患者，采用VAS 法對患者進行疼痛評分。在VAS 卡中心刻有數(shù)字的10cm 長線上有可滑動的游標，兩端分別表示“無痛”(0)和“最劇烈的疼痛”(10)?；颊呙鎸o刻度的一面，患者將游標移至當時最能代表疼痛程度的部位；醫(yī)生面對有刻度的一面，并記錄疼痛程度。疼痛評分：無痛記為0 分，輕度疼痛(1-4cm)記為1 分，中度疼痛(5-7cm)記為2 分，重度疼痛(8-10)記為3 分。子宮大小的改變以三個徑線的乘積為子宮體積的計算量進行統(tǒng)計，有專人應(yīng)用陰道彩超測量子宮體積：大于350cm3為子宮增大[8,9]。按月經(jīng)失血圖（PBAC）[10]對月經(jīng)量評分。方法收集患者使用完畢后的每張衛(wèi)生巾，根據(jù)月經(jīng)失血圖每張衛(wèi)生巾的血染程度分為：輕度，血染面積占衛(wèi)生巾的1/3 及以下，計1 分；中度，血染面積占衛(wèi)生巾的1/3-3/5，計5 分；重度，血染面積基本為整個衛(wèi)生巾，計20 分。遺失血塊大小小于1 元硬幣，屬小血塊，計1 分；大于等于1 元硬幣，屬大血塊，計5 分。評估整個經(jīng)期的月經(jīng)量。評分＞100 分月經(jīng)量≥80mL。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用獨立樣本t檢驗及均數(shù)±標準差（±s）表達；采用確切概率法(Fisher's exact test)分析AM 組與對照組患者的一般臨床特征，及COX-2、VEGF、 Galectin-3 表達與AM 患者痛經(jīng)、月經(jīng)量的關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AM 組與對照組臨床特征的關(guān)系

如表1 所示：AM 組與對照組患者的子宮大小、月經(jīng)量、痛經(jīng)之間的關(guān)系差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,兩組患者的年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 AM 組與對照組患者的一般臨床特征

3.2 免疫組化檢測

兩組內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達（圖1）如表2 所示：AM 患者異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 表達均高于在位內(nèi)膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但AM 患者在位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 表達與對照組在位內(nèi)膜相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 ELASA 檢 測AM 組、對照組 COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的相對表達

AM 組血清中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

3.4 AM 組異位、在位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達與痛經(jīng)、月經(jīng)量的關(guān)系

對照組中患者無明顯月經(jīng)量增多及痛經(jīng)，因此本研究僅統(tǒng)計AM 組各因子與痛經(jīng)及月經(jīng)量的關(guān)系。AM組中COX-2 的表達與痛經(jīng)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.797，P＜0.05），VEGF、Galectin-3 的表達與痛經(jīng)無顯著相關(guān)（χ2=3.697P=0.083，χ2=0.522，P=0.650）；AM 組中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達與月經(jīng)量無顯著相關(guān)（χ2=0.026，P=1.000,χ2=0.317，P=0.709,χ2=0.110P=1.000），見表4。

圖1 免疫組化檢測COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白在內(nèi)膜組織中的表達（SP,×100)

表2 AM 組、對照組在位、異位內(nèi)膜COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達

表3 AM 組與對照組血清中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達

表4 AM 組COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達與痛經(jīng)、月經(jīng)量的關(guān)系

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮體以外的部位,AM 卻是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮肌層彌漫性或局限性生長。二者雖發(fā)病機制不完全一致，但卻有共同的臨床特點：如兩者雖為良性疾病，卻均具有惡性腫瘤的一些特征，如血管生成、局部或遠處的浸潤、生長等。子宮內(nèi)膜異位癥和AM 的發(fā)病機制目前尚未明確，Sampson 提出的“經(jīng)血逆流”學(xué)說一直是子宮內(nèi)膜異位癥經(jīng)典的發(fā)病理論，脫落的子宮內(nèi)膜伴隨經(jīng)血通過輸卵管逆流并種植于盆腔，形成子宮內(nèi)膜異位癥。而這一理論不能完全解釋腺肌病，于是，很多學(xué)者認為子宮內(nèi)膜異位癥和AM 是兩種完全不同的疾病。AM 通常用子宮基底層內(nèi)膜內(nèi)陷學(xué)說來解釋，多次妊娠及分娩、人工流產(chǎn)、慢性子宮內(nèi)膜炎等造成子宮內(nèi)膜基底損傷，內(nèi)膜基底層缺乏粘膜下層保護，子宮內(nèi)膜易“侵入遷延”至肌層。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對AM 發(fā)病機制的研究也不斷進展，血管生成、細胞因子、炎性介質(zhì)、上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、甾體激素的作用等可能參與了AM 的發(fā)生、發(fā)展過程，對AM 發(fā)病機制的研究有望為臨床診斷和治療提供新思路[11,12]。

AM 是一種雌激素依賴性疾病，COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素（PGs）的主要限速酶，AM 患者中COX-2 通過促進PGs 的合成增加，激活更多的芳香化酶（P450arom）促進雌二醇（E2）合成增加，E2 與P450arom 之間存在一個惡性的正反饋循環(huán)[13,14]。PGs 主要為PGE2 和前列腺素F2a(PGF2a),均可以引起痛經(jīng)，PGF2a 能刺激血管強烈的收縮，PGF2a 作用于PGF2a 受體（PTGFR）引起子宮平滑肌收縮過強，血管痙攣，導(dǎo)致子宮局部組織缺血缺氧而出現(xiàn)痛經(jīng)[15]。AM 患者中致痛因子作用于外周神經(jīng)，造成相應(yīng)的感受器數(shù)量和神經(jīng)纖維密度增加，造成痛覺敏化提高傷害感受器的敏感性，導(dǎo)致痛覺過敏[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AM 組中COX-2 的表達與痛經(jīng)的關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示AM 組中COX-2 過表達促進疼痛因子PGs 合成增加，引發(fā)痛經(jīng)，嚴重痛經(jīng)會影響婦女的生活質(zhì)量。本課題組的前期研究增提示沉默COX-2 因子，會導(dǎo)致子宮腺肌病間質(zhì)細胞中的VEGF，MMP-9mRNA 和蛋白表達下調(diào)。因此，COX-2 可能是子宮腺肌病發(fā)病及痛經(jīng)的主要作用靶點和始動因素。COX-2 有望成為治療子宮腺肌病患者痛經(jīng)的重要分子靶點。

VEGF 是促進血管生成的關(guān)鍵因子，能夠促進內(nèi)皮細胞分裂、刺激新生血管生成、提高血管的通透性、改變細胞外基質(zhì)促進血管內(nèi)皮細胞的遷移等[18]。研究表明[19]VEGF 高表達與AM 發(fā)病機制有關(guān)，促進異位病灶血管的形成。Galectin-3 屬于半乳糖凝集素家族，主要參與細胞的增殖、分化、凋亡，介導(dǎo)細胞間黏附和免疫調(diào)節(jié)等多種作用，近年來發(fā)現(xiàn)，Galectin-3與炎癥反應(yīng)、新生血管的形成及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等有關(guān)[20,21]。本研究結(jié)果顯示COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 患者血清、異位內(nèi)膜組織中的表達均高于對照組，提示三因子可能參與AM 的發(fā)生。本研究中COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 在位內(nèi)膜組織中的表達與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義，但血液中表達高于對照組，提示AM 的發(fā)生除了局部內(nèi)膜的異位侵襲起作用外，全身性其他的因素（如免疫因素）可能也參與AM 的發(fā)生、發(fā)展。

AM 患者子宮肌層呈彌漫性生長，肌層纖維增生影響子宮收縮，且常合并子宮內(nèi)膜增生，導(dǎo)致月經(jīng)量過多[22]。AM患者子宮內(nèi)膜表層血管生成活躍，異位病灶中血管生成及毛細血管數(shù)量在增殖期和分泌期都明顯增加，這些變化可能會促進異位病灶的活性，從而導(dǎo)致子宮增大、月經(jīng)量增多[23,24]。COX-2、VEGF、Galectin-3 均參與新生血管的形成，而本研究中COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 組子宮異位內(nèi)膜中的表達均與月經(jīng)量無明顯相關(guān)性，提示COX-2、VEGF、Galectin-3可能在疾病的早期參與AM 的發(fā)生，而AM 患者月經(jīng)量增多則為子宮腺肌病進展到一定程度后發(fā)生的晚期事件，因此三者的表達與AM 月經(jīng)量無顯著相關(guān)。

綜上所述，AM 的發(fā)病機制仍尚不明確，COX-2、VEGF、Galectin-3 可能參與AM 的發(fā)生。COX-2 過表達是導(dǎo)致痛經(jīng)的重要因素之一，有望成為治療痛經(jīng)的分子靶點。但本研究收集的樣本量較少，其與AM 的關(guān)系有待于采取前瞻性進一步大樣本研究。