鄧文祥趙漫麗王自林李永梅

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)問農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南城市建設(shè)職業(yè)學(xué)院，云南 昆明 651700）

白及（Bletilla striata）是地生蘭科白及屬多年生草本植物，莖基部具膨大假鱗莖，肉質(zhì)，富黏性，生數(shù)條細長根[1]。白及用于止血，散熱利濕，消腫、生肌等人體病癥，是我國較為常見的中藥材[2]。白及塊莖已經(jīng)在工業(yè)和食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其藥用成分白及多糖則被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[3]。研究表明，內(nèi)生真菌在蘭科植物整個生長史中有著不可替代的作用：在種子萌發(fā)，水分、養(yǎng)分吸收，抗病，促生等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，能夠促進植株生長。同時，藥用植物內(nèi)生真菌在有效成分合成過程中，起著積極的誘導(dǎo)作用[4-5]。成熟白及種子細小，胚發(fā)育不全，且無胚乳[6]，僅依靠自身營養(yǎng)物質(zhì)，難于在自然條件下萌發(fā)。所以外源養(yǎng)分對其種子萌發(fā)具有重要意義。

本研究于2009—2017年不間斷對白及種子進行無菌化培養(yǎng)，利用實驗室條件提供充足氮、磷、鉀和微量元素，以及添加劑和植物生長調(diào)節(jié)劑對其進行調(diào)控，能夠較好的促進白及種子無菌萌發(fā)，并能得到較為茁壯的幼苗。但在白及煉苗過程中，白及幼苗總會受到外來病原菌侵染，根部、假鱗莖與葉片結(jié)合部位出現(xiàn)腐爛癥狀，在采取化學(xué)、物理防治后，也不能有效控制該病情的發(fā)生。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于白及藥理、組培、化學(xué)、資源等領(lǐng)域的研究較多。關(guān)于白及和黃花白及（Bletilla ochracea）內(nèi)生真菌組成及多樣性研究，已有少量報道[7-8]，但都是對可培養(yǎng)型內(nèi)生真菌進行分析研究，劉準等研究表明[8]，僅對黃花白及可培養(yǎng)型內(nèi)生真菌的多樣性分析，其多樣性指數(shù)往往會被低估。有關(guān)云南白及根部內(nèi)生真菌物種組成和種群差異的研究報道較少，本研究旨在應(yīng)用高通量測序，對白及根部內(nèi)生真菌物種豐度和種群差異進行分析，深入了解云南原生境白及根部內(nèi)生真菌組成和分布情況，為后續(xù)相關(guān)生防菌株資源培養(yǎng)與篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植株材料

供試植株主要采集于云南省楚雄市南華縣緩坡灌木林下雜草叢中，該地年降雨量為823 mm，采集到不同地理位置的白及植株樣品3個，HCN 1共計采集14苗，HCN 2共計采集9苗，HCN 3共計采集15苗，共采集38苗。采樣過程中，同時將白及根部土壤一起采集，確保植株根系完整。楚雄市南華縣位于云南中部，楚雄市西部，南華縣地處低緯度高海拔地區(qū)，以北亞熱帶季風(fēng)氣候為主，兼有大陸性和海洋性氣候特點，立體氣候明顯。據(jù)本研究調(diào)查，該采樣區(qū)域自2015年至今，降雨量偏少，且降雨不均，局部干旱時有發(fā)生，植被覆蓋率較其他采樣區(qū)域較低。采集植株樣品生境見表1。

表 1 采集植株樣品生境Table 1 Physical environment of sampling sites

1.2 試驗方法

1.2.1 根部表面消毒

具體包括以下步驟：1）選取健康成活植株；2）自來水流動沖洗根表面，直至去除表面附著物；3）采用國家發(fā)明專利ZL 2015101400150.7[9]進行無菌化處理，先用質(zhì)量分數(shù)3‰～10‰吐溫、0.1‰～2.0‰K2MnO4、1%～3% NaClO、0.1%HgCl2，各試劑依次處理1.5 min，用無菌水沖洗4～6次，再用以上4種試劑重復(fù)處理1次，最后再無菌水沖洗4～6次，處理結(jié)束后，置于無菌環(huán)境中備用。

1.2.2 基因組DNA提取

使用特定的DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）進行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.3 PCR擴增

引物：ITS3_KYO2(5′ ? GATGAAGAACGYAGYRAA?3′)和 ITS4(5′?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3′)[10]以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進行PCR。每1個25 μL的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD?Plus?Neo 酶（TOYOBO）和 10 ng 模板。PCR程序包括起始 94 ℃ 1 min，然后 30個 循環(huán)（變性 94 ℃20 s，退火 48 ℃ 30 s和 延伸 72 ℃ 30 s），最后 72 ℃5 min。每個樣本進行3個PCR技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測、純化和定量

PCR 與 1/6 體積的 6X loading buffer 混合，使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回 收 使 用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)。使 用Qubit@ 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)定量，最后等摩爾量混合。

1.2.5 建庫和測序

建庫使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測合格后，使用羅寧生物科技公司的Hiseq 2500平臺PE250模式測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 序列處理

使用FLASH[11]拼接雙端序列?；贐arcode從reads中拆分出各樣品序列。截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù)，然后使用Trimmomatic[12]進行質(zhì)控。得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads。

1.3.2 聚類分析

基于Usearch（http://drive5.com/uparse/）軟件，使用UPARSE算法[13]在97%的一致性水平上進行OTU聚類，挑選每個OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU的代表序列。使用UCLUST分類法[14]與UNITE 數(shù)據(jù)庫（https://unite.ut.ee/）進行注釋分析。使用MAFFT version 7 的 FFT?NS?2算法[15]將代表性序列進行多重比對。使用Fast-Tree[16]構(gòu)建進化樹。對各樣本做均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行重抽樣。

1.3.3 群落組成分析

使用R語言[17]進行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。使用ggplot2包作圖。使用R語言中phyloseq包提取特定分類水平的群落組成，并使用mean函數(shù)計算各組樣品中各物種的均值，使用pheatmap包繪制熱圖。為了方便展示關(guān)注的物種分類層次、物種豐度以及樣本間的比較，使用特定的物種分類樹進行研究。步驟為對每個樣品的物種分類結(jié)果，篩選特別關(guān)注的物種（選擇最大相對豐度前10的屬）進行物種分類樹統(tǒng)計，3個樣品中的特定物種分類樹將進行比較分析。應(yīng)用SPSS 17.0 分析各樣本內(nèi)生真菌豐度與采樣點土壤因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

選取豐度排名前50的OTU進行系統(tǒng)發(fā)育（圖1）分析，明顯分為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），置信度均大于95%。

圖 1 高豐度OTU系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the high abundance OTU

子囊菌門，在樣本HCN 1和HCN 3中，Leoti omycetes、Erysiphales、Erysiphaceae的Podosphaera和Erysiphe在相近發(fā)育枝上，置信度大于95%；在樣本HCN 1和HCN 3中，Eurotiomycetes、Eurotiales、Trichocomaceae、Aspergillus的Aspergillussp.在同一發(fā)育枝之上，置信度大于95%；在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Sordariomycetes、Incertae sedis、Glomerellaceae、Glomerella的Glomerella cingulata的置信度為90%；Dothideomycetes、Botryosphaeriales、Botryosphaeriaceae的Phyllosticta置信度大于95%。

擔(dān)子菌門中，Microbotryomycetes、Sporidiobolales、Incertae sedis，Rhodosporidium的Rhodosporidium diobovatum和Agaricostilbomycetes、Agaricostilbales、Agaricostilbaceae、Sterigmatomyces的S. halophilus在相近發(fā)育枝上，在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，置信度為89%。

2.2 內(nèi)生真菌群落分布及組成分析

如圖2所示，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Ascomycota豐度分別為98.48%、95.70%、96.71%；Basidiomycota豐度分別為0.51%、4.30%、1.52%。

圖 2 高豐度門水平類群熱圖Fig.2 Heatmap of high abundance at the phylum level

如圖3所示，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Dothideomycetes豐度均最高，依次分別為95.95%、93.92%、91.90%；Eurotiomycetes豐度依次為1.07%、0.51%、2.53%；Sordariomycetes豐度依次為0.25%、1.27%、1.27%；Agaricostilbomycetes豐度依次為0.51%、0.51%、0.25%；Tremellomycetes豐 度 為2.78%（HCN 2）、0.25%（HCN 3）；Leotiomycetes豐度為0.76%（HCN 1）、1.01%（HCN 3）；Agaricomycetes豐 度為1.01%（HCN 2）；Exobasidiomycetes和Microbotryomycetes在HCN 3中豐度均為0.51%。

如圖4所示，在目水平上，樣品HCN 1中物種豐度大小依次為Capnodiales 2.03%、Botryosphaeriales 1.77%、Erysiphales和Agaricostilbales豐度 均 為0.51%、Eurotiales 1.01%、Incertae sedis 0.25%；樣品HCN 2中物種豐度大小依次為Incertae sedis 1.27%、Eurotiales 和Agaricostilbales均為0.51%，Pleosporales、Capnodiales、Botryosphaeriales、Cystofilobasidiales和Polyporales豐度均為0.25%；樣品HCN 3中物種豐度依次為Botryosphaeriales 2.78%、Eurotiales 2.53%、Incertae sedis 1.27%、Capnodiales和Erysiphales豐度均是 1.01%，Pleosporales、Microstromatales 和Sporidiobolales豐度均為 0.51%，Agaricostilbales 和Cystofilobasidiales豐度均是 0.25%。

圖 3 高豐度綱水平類群熱圖Fig.3 Heatmap of high abundance at the class level

如圖5所示，在科水平上，樣品HCN 1中物種豐度大小依次為Botryosphaeriaceae 1.77%、Erysiphaceae和Mycosphaerellaceae均為0.76%、Trichocomaceae和Agaricostilbaceae均為0.51%、Glomerellaceae 0.25%；樣品HCN 2中物種豐度大小依 次 為Glomerellaceae 1.27%、Agaricostilbaceae 0.51%，Botryosphaeriaceae、Mycosphaerellaceae、Montagnulaceae、Cystofilobasidiaceae、Polyporaceae豐度均為0.25%；樣品HCN 3中物種豐度大小 依 次 為Botryosphaeriaceae 2.78%、Trichocomaceae 2.28%、Glomerellaceae 1.27%、Erysiphaceae 1.01%、Montagnulaceae和Incertae sedis均為0.51%，Agaricostilbaceae、Mycosphaerellaceae、Cystofilobasidiaceae 豐度均為0.25%。

如圖6所示，選擇在屬水平上物種豐度排名前50的進行排序，生成熱圖進行群落組成分析。樣品HCN 1中各菌屬豐度從大到小依次為：Phyllosticta1.77%、Aspergillus0.51%、Erysiphe0.51%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Podosphaera

0.25%、Glomerella cingulate0.25%；樣 品HCN 2中各菌屬豐度從大到小依次為：Glomerella cingulate1.27%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Phyllosticta0.25%；在樣品HCN 3中各菌屬豐度從大到小依次為：Phyllosticta2.78%、Aspergillus

1.27%、Erysiphe1.01%、Sterigmatomyces halophilus0.25%、Rhodosporidium diobovatum0.51%。

如圖7所示，選擇在種水平上物種豐度進行排序，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3 中，Glomerella cingulata豐度依次為0.25%、1.27%、1.27%，Sterigmatomyces halophilus豐 度 依 次 為0.51%、0.51%、0.25%，Dothideomycetessp.豐度依次為0.51%、2.53%、0.76%；樣品HCN 1中，Ascomycotasp.的豐度為0.51%；樣品HCN 2中Tremellomycetessp.的豐度為2.03%；樣品HCN 3中，Aspergillussp.的 豐 度 為1.01%，Rhodosporidium diobovatum的豐度為0.51%。

圖 4 高豐度目水平類群熱圖Fig.4 Heatmap of high abundance at the order level

圖 5 高豐度科水平類群熱圖Fig.5 Heatmap of high abundance at the family level

圖 6 在屬水平的高豐度熱圖Fig.6 Heatmap of high abundance at the genus level

圖 7 高豐度種水平類群熱圖Fig.7 Heatmap of high abundance at the species level

2.3 特定物種分類樹分析

對HCN 1、HCN 2、HCN 3 樣本中豐度前10的屬進行特定物種分類樹分析。由圖2～8可知：子囊菌門占總樣本群落豐度的96.46%。是該采樣點的優(yōu)勢菌門。擔(dān)子菌門，占物種總豐度的2.11%。Sterigmatomyces halophilus占物種總豐度的0.42%，占該分類層次物種豐度的11.9%，是HCN 1、HCN 2、HCN 3 樣本中共有菌屬；子囊菌門，占總物種豐度的96.96%。Podosphaera和Erysiphe分別占物種總豐度的0.08%、0.51%，分別占該Erysiphaceae分類層次物種豐度的2.38%和14.29%，其中，Podosphaera是HCN 1中獨有菌屬，關(guān)于Erysiphe物種豐度，HCN 3高于HCN 1樣本中豐度；Aspergillus占總物種豐度的0.93%，占Trichocomaceae分類層次物種豐度的26.19%，HCN 3高于HCN 1樣本中豐度；Phyllosticta占總物種豐度的1.6%，占Botryosphaeriales分類層的45.24%，樣品HCN 3、HCN 1、HCN 2物種豐度依次降低。

圖 8 特定物種分類樹Fig.8 Specific taxonomic tree

2.4 內(nèi)生真菌物種豐度與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

如表2所示，3個采樣區(qū)域中，根部土壤pH、全碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀均有一定的正負相關(guān)性。其中，HCN 1和HCN 3樣品物種豐度與全氮顯著正相關(guān)；HCN 3物種豐度與全磷顯著負相關(guān)，HCN 2物種豐度與速效鉀極顯著負相關(guān)。

表 2 不同采樣點根部內(nèi)生真菌物種豐度與土壤因子的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of endophytic fungus species abundance and soil factors in different collection sites

3 結(jié)論與討論

該采樣區(qū)域的白及植株根部內(nèi)生真菌主要是擔(dān)子菌門，豐度值為2.11%，子囊菌門，豐度高達96.96%，是該區(qū)域的優(yōu)勢菌門。

Phyllosticta是 樣 本HCN 1、HCN 2、HCN 3中豐度均在前10的物種，是高豐度菌屬。有研究證明，Phyllosticta是廣泛引起世界范圍內(nèi)植物葉枯病和葉斑病的主要致病菌，在果樹上病癥表現(xiàn)尤為突出[18]，但也有研究證明Phyllosticta capitalensis和P. paracapitalensis對P. citricarpa具 有拮抗作用[19]。Erysiphe在HCN 1和HCN 3豐度分別在0.51%和1.01%。研究發(fā)現(xiàn)，Erysiphe對大多植物有致病性[20]，Erysiphe中的白粉菌是常見的專性寄生真菌，能夠侵染多種瓜果類農(nóng)作物，并造成嚴重危害[21]，本研究關(guān)于白及屬植物病害調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，白粉病時有發(fā)生。與Erysiphe處于相近發(fā)育枝的Podosphaera也是引起植物白粉病的重要病原菌[22-24]。在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中的豐度均在前10的物種還有Glomerella cingulata，豐度均處于較高水平。研究表明，Glomerella cingulata對果蔬和花卉植物均具有致病性[25-29]。在蘭科石斛中Glomerella也被分離出來，是石斛根部內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬[30]。Glomerella cingulata與蘋果GlomerellaLeaf Spot密切相關(guān)[31]；該屬對辣椒、橄欖、山茶花、雪松，蘋果等植物都有致病性[25,27,29]。同時也是引起蘭科植物鐵皮石斛炭疽病的病原菌之一[32]。

而在樣本HCN 1、HCN 3中存在的Aspergillus在植物生防領(lǐng)域有著積極作用[33-34]，特別是Aspergillus versicolor次生代謝產(chǎn)物中的吲哚?3?乙酸（IAA）和氨，促進共生植株根、莖、葉的生長[35-36]。從大豆根部分離的Aspergillus fumigatussp.LH02，能夠顯著增加大豆植株莖長、鮮干質(zhì)量、葉面積、葉綠素含量[37]。Aspergillussp.KJ-9的7種代謝產(chǎn)物對Gibberella saubinetti、Magnaporthe grisea、Botrytis cinerea、Colletotrichum gloeosporioides、Alternaria solani等致病菌有抑制作用[38]。Rhodosporidium diobovatum在HXJ1和HXJ2中的豐度均為1.27%。已有研究結(jié)果表明，該菌種的代謝產(chǎn)物對植物促生和生防也有較好效果[39]。Rhodosporidium toruloides是一種多用途真菌，能產(chǎn)生生物催化劑、氨基酸、脂質(zhì)等物質(zhì)[40-41]，R. toruloidesY4對木質(zhì)纖維素衍生的抑制劑具有較好的耐受性[42]。

擔(dān) 子 菌 門 中，Sterigmatomyces halophilus在3個樣本中均有分布，Antunes和Aguiar對Sterigmatomyces halophilus進行了系統(tǒng)性描述，并指出該菌種在生態(tài)和工業(yè)中有較好應(yīng)用前景，其代謝產(chǎn)物在生防領(lǐng)域也有較好利用價值，可作為生防菌株研究利用[43]，同時Sterigmatomyces halophilus對土壤重金屬有較好的吸附性，具有一定的生態(tài)修復(fù)功能[44]。

在各樣本中同時有病原菌和生防菌株的存在，但植株并未見明顯的患病病癥。分析發(fā)現(xiàn)，在樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Phyllosticta、

Aspergillus、Sterigmatomyces halophilus、Rhodosporidium diobovatum等菌屬已經(jīng)在其他植物研究中被發(fā)現(xiàn)具有促生和生防作用。本研究中，以上物種在屬種水平上豐度總體處于優(yōu)勢地位，豐度高于Glomerella cingulata、Erysiphe、Podosphaera等已經(jīng)被公認的致病菌豐度值。3個不同采樣點白及根部組織中存在一定豐度的致病菌，同時也有較高豐度的益生真菌共存。這一結(jié)果為后續(xù)益生白及內(nèi)生真菌篩選和致病菌分析提供了依據(jù)。

3個樣品間的采樣距離和地理位置差異是引起白及根部內(nèi)生真菌組成差異的影響因子之一。不同的土壤理化性質(zhì)與白及根部內(nèi)生真菌物種豐度之間存在直接相關(guān)性，是白及根部內(nèi)生真菌物種組成差異的主要影響因素。