劉芳遠(yuǎn)，蘇秀蘭

0 引言

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma,GBM）是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腦腫瘤，5年生存率僅4.7%，患者預(yù)后不足15月[1]。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的診斷和治療十分重要。CXC趨化因子家族共包含16個(gè)成員，參與諸多生物學(xué)過程，如血管生成[2]、腫瘤生長[3]以及免疫響應(yīng)[4]等。CXC趨化因子能夠通過免疫途徑影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2,5]，也可以作為多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物[6-7]。

近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道CXC趨化因子在GBM中能夠發(fā)揮重要作用[8-9]，但其在GBM治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物方面的研究仍然有待深入。生物信息學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立為分析CXC趨化因子提供了工具和平臺(tái)。本研究對(duì)CXC趨化因子在GBM中的表達(dá)進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，利用TCGA數(shù)據(jù)庫中GBM的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床表型數(shù)據(jù)，結(jié)合大型公共數(shù)據(jù)庫評(píng)估CXC趨化因子作為GBM治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，旨在為GMB患者早期診斷及治療方案提供一定的幫助。

1 資料與方法

1.1 查看CXC趨化因子在GBM的表達(dá)情況

利用ONCOMINE[10]查看CXC趨化因子家族中16個(gè)成員在多種腫瘤中的表達(dá)情況。利用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫[11]分別對(duì)16個(gè)CXC趨化因子家族成員在腫瘤組織樣本（n=163）和正常組織樣本（n=207）中的表達(dá)情況進(jìn)行差異分析，使用ANOVA方差分析對(duì)差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 分析CXC趨化因子對(duì)GBM患者預(yù)后的影響

利用GEPIA計(jì)算差異表達(dá)CXCL趨化因子的患者總生存期（overall survival,OS）和無病生存期（disease-free survival,DFS）。使用Log rank檢驗(yàn)對(duì)生存率曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 計(jì)算CXC趨化因子的表達(dá)相關(guān)性

使用R軟件corrplot程序包分析CXC趨化因子在GBM中表達(dá)的相關(guān)性，使用Pearson相關(guān)系數(shù)說明和驗(yàn)證分析結(jié)果。

1.4 構(gòu)建CXC趨化因子及其鄰近蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

在String數(shù)據(jù)庫[12]導(dǎo)入差異表達(dá)的CXC趨化因子構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)連接分?jǐn)?shù)得到28個(gè)鄰近結(jié)點(diǎn)（combine score＞0.4）。使用Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)度（連接蛋白的數(shù)量）得出網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5 利用DAVID工具進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

使用DAVID（http://david.ncifcrf.gov）在線分析工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的所有結(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析[13]，分別得到CXC趨化因子及其鄰近基因在生物學(xué)過程（biological process,BP）和途徑、細(xì)胞組分（cellular component,CC）和定位及分子功能（molecular function,MF）的富集情況。使用DAVID分析工具進(jìn)行KEGG通路富集分析，富集條件以P＜0.05為閾值。

1.6 預(yù)測(cè)CXC趨化因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和激酶靶標(biāo)

通過TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/）預(yù)測(cè)CXC趨化因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14]。使用LinkedOmics（http://www.linkedomics.org/）預(yù)測(cè)差異表達(dá)趨化因子的激酶靶標(biāo)。

1.7 分析CXC趨化因子在GBM的免疫浸潤水平

使用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）數(shù)據(jù)庫查詢CXC趨化因子的表達(dá)與腫瘤純度和免疫細(xì)胞浸潤程度的關(guān)系[15]。在TIMER中，使用Pearson相關(guān)性分析計(jì)算腫瘤純度與基因表達(dá)之間的相關(guān)性，使用Spearman相關(guān)性分析計(jì)算6種免疫細(xì)胞浸潤程度與基因表達(dá)的關(guān)系，采用偏相關(guān)分析方法排除腫瘤純度對(duì)免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 CXC趨化因子在GBM中的異常表達(dá)

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，CXCL8/9/10/11在腫瘤中的表達(dá)明顯上調(diào)，見圖1A。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，CXCL2/3/8/9/10/11/16在GBM中的表達(dá)上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。此外，CXCL6/13/17在GBM和正常組織中表達(dá)差異并不顯著（P＞0.05），CXCL14在GBM中則出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)，CXCL1/4/5/7/12在GBM中的表達(dá)高于正常組織，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上表明，CXC趨化因子在GBM中普遍高表達(dá)。

2.2 CXC趨化因子對(duì)GBM患者預(yù)后的影響

OS分析曲線結(jié)果表明，CXCL3（P=0.021）、CXCL8（P=0.049）與GBM患者的不良預(yù)后存在顯著相關(guān)性。DFS分析曲線顯示，CXCL1（P=0.012）、CXCL5（P=0.0078）、CXCL6（P=0.015）和CXCL14（P=0.031）的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致GBM患者無病生存期縮短，見圖2。

2.3 GBM中CXC趨化因子的共表達(dá)及相鄰基因網(wǎng)絡(luò)分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，CXCL2、CXCL3和CXCL8的表達(dá)存在較高的相關(guān)性（r2,3=0.86,r2,8=0.62,r3,8=0.76）；CXCL9、CXCL10和CXCL11也存在較高的相關(guān)性（r9,10=0.63,r9,11=0.64,r10,11=0.76），構(gòu)成了另一個(gè)表達(dá)模塊。在預(yù)測(cè)的與CXC趨化因子相關(guān)的28個(gè)鄰近基因中，一些基因如IL4、IL6、IL10、CCL2、CCL4、STAT3等，均與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，見圖3。

圖1 CXC趨化因子在泛癌及腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Figure 1 Expression of CXC chemokines in pan-cancer and glioblastoma (GBM)

2.4 GBM中CXC趨化因子及相鄰基因的功能富集分析

GO功能富集分析顯示，BP分析中，基因主要富集在趨化因子介導(dǎo)信號(hào)通路、免疫應(yīng)答、細(xì)胞趨化作用和炎性反應(yīng)響應(yīng)等與免疫有關(guān)的功能上，見圖4A。細(xì)胞外區(qū)域、胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞膜外表面則是CC中富集最高的成分，見圖4B。而在分子功能中，CXC趨化因子及其鄰近基因主要富集于趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合等趨化因子調(diào)節(jié)功能，見圖4C。KEGG通路分析顯示，基因集主要富集在細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、NOD-like受體信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等免疫相關(guān)的信號(hào)通路上，見圖4D。

2.5 GBM中CXC趨化因子的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和激酶靶點(diǎn)

圖2 腦膠質(zhì)瘤患者差異表達(dá)趨化因子的總生存期和無疾病生存期分析Figure 2 Overall survival curves and disease-free survival curves of GBM patients with differentially-expressed CXC chemokines

圖3 CXC趨化因子的表達(dá)相關(guān)性分析(A)及其28個(gè)鄰近基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(B)Figure 3 Correlation analysis of CXC chemokines expression(A) and PPI network of 28 neighbor genes(B)

從TRRUST數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中，我們得到兩個(gè)參與調(diào)控CXC趨化因子的轉(zhuǎn)錄因子，分別是RELA和NFKB1，重要的是，RELA和NFKB1共同參與了CXCL2、CXCL8和CXCL10的調(diào)控。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對(duì)CXC趨化因子激酶靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞特異性激酶（lymphocytespecific kinase）是CXCL3/9/10/11的激酶靶點(diǎn)；此外，Rad3相關(guān)蛋白（Rad3-related protein,ATR）被證明為CXCL2的激酶靶點(diǎn)；有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1（CHEK1）和LCK/YES相關(guān)蛋白酪氨酸激酶（Lck/Yes related novel protein tyrosine kinase,LYN）則分別是CXCL8和CXCL16的激酶靶點(diǎn)，見表1。

2.6 GBM中CXC趨化因子的免疫細(xì)胞浸潤

TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，GBM中CXC趨化因子與腫瘤微環(huán)境中6種免疫細(xì)胞的浸潤水平呈一定相關(guān)性。其中，CXCL2表達(dá)與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)性，見圖5A。CXCL3表達(dá)與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；CXCL8（IL8）表達(dá)與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)性，與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，見圖5B；CXCL9的表達(dá)與B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤、CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；CXCL10的表達(dá)與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤、CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖5C；與CXCL10類似，CXCL11與B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤、CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而CXCL16的表達(dá)僅與CD8+T細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤均呈正相關(guān)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的GO分析和KEGG通路富集分析Figure 4 GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis of genes in PPI network

表1 差異表達(dá)CXC趨化因子的激酶靶點(diǎn)Table 1 Kinase target for differential expression of CXC chemokines in GBM

3 討論

CXC趨化因子在免疫細(xì)胞的成熟、分化和遷移過程中發(fā)揮重要作用[4]。在腫瘤中，CXC趨化因子被證明對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤水平和免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。在GBM中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的通訊會(huì)對(duì)各類細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而為腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移提供特定的微環(huán)境[18-19]。CXC趨化因子對(duì)腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫具有十分重要的意義，其在GBM的靶點(diǎn)研究、預(yù)后及免疫治療等方面具有廣闊的研究前景[19]。然而，在GBM中CXC趨化因子的預(yù)后價(jià)值和作用機(jī)制尚不明確。本研究探討了CXC趨化因子在GBM中的表達(dá)情況，結(jié)果表明GBM中有7個(gè)基因與正常組織有差異表達(dá)（CXCL2/3/8/9/10/11/16的表達(dá)顯著上調(diào)）。預(yù)后分析結(jié)果顯示CXCL3和CXCL8的異常表達(dá)與GBM患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。此外，Bruyère等研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)CXCL2/3/8在GBM組織中表達(dá)上調(diào)會(huì)影響使用替莫唑胺化療的療效[8]。這些結(jié)果表明，CXCL3和CXCL8的異常表達(dá)對(duì)GBM的發(fā)展、生存預(yù)后和治療都有影響，但具體機(jī)制尚不明確。

圖5 差異表達(dá)CXC趨化因子與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation between differently-expressed CXC chemokines and immune cell infiltration

由于多種趨化因子在GBM中的表達(dá)具有顯著差異，本研究進(jìn)一步分析了它們?cè)贕BM中的功能。結(jié)果表明CXC趨化因子之間存在或高或低的相關(guān)性，并形成了相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，表明這些細(xì)胞因子在GBM的發(fā)生可能以組成網(wǎng)絡(luò)的方式發(fā)揮作用。然后，我們構(gòu)建由差異表達(dá)的CXC趨化因子及其鄰近基因組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，得到了與其相互作用最為密切的28個(gè)鄰近基因，并對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的所有基因進(jìn)行了GO富集分析和KEGG通路富集分析，以探求CXC趨化因子及其鄰近基因主要參與的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中基因主要富集于趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子間受體相互作用以及TNF信號(hào)通路。有研究表明，趨化因子信號(hào)通路在多種癌癥的增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃避中發(fā)揮重要作用[20-21]，而TNF信號(hào)通路的激活也被證明對(duì)GBM的發(fā)展具有抑制作用[22]。由此得出，差異表達(dá)的CXC趨化因子對(duì)GBM具有潛在的調(diào)控作用。

為了探究CXC趨化因子在GBM中作為潛在的藥物治療靶點(diǎn)的作用，本研究還分析了CXC趨化因子的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)RELA和NFKB1可能是調(diào)控CXC趨化因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。RELA蛋白的磷酸化能夠影響諸多疾病的進(jìn)展，尤其是可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路影響炎性疾病和癌癥[23-24]。另一項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中RELA能夠影響由癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[25]。NFKB1能夠通過減少NF-κB信號(hào)通路的異常激活抑制多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[26]。此外，Plaisier等通過分析后預(yù)測(cè)NFKB1能夠協(xié)同ETV6抑制GBM的增殖[27]。

此外，我們進(jìn)一步預(yù)測(cè)了CXC趨化因子的激酶靶點(diǎn)，作為CXCL3/9/10/11的激酶靶點(diǎn)，LCK是調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育和T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵因子之一。LCK也在多種腫瘤中表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、膽管癌和肺癌，并且可能是這些腫瘤的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[28]。在GBM中，LCK被證實(shí)與GBM細(xì)胞順鉑耐藥性的增強(qiáng)有關(guān)，不僅如此，抑制LCK的表達(dá)對(duì)GBM細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力也會(huì)產(chǎn)生影響[29]。ATR激酶與細(xì)胞對(duì)基因組不穩(wěn)定的響應(yīng)和修復(fù)有密切聯(lián)系，在腫瘤中ATR的激活能夠增強(qiáng)藥物化療后細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)。目前，幾種ATR抑制劑，如ETP46464、AZ20、VE822，在癌癥小鼠模型體內(nèi)的功效均得到了驗(yàn)證，臨床上也針對(duì)ATR抑制劑的治療敏感度開發(fā)了幾種生物標(biāo)志物，用于診斷合適的患者群體并采取對(duì)應(yīng)治療手段[30]。免疫細(xì)胞浸潤已被證明可以影響腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)，并對(duì)腫瘤的免疫治療和臨床效果具有重要的作用[31-32]。CD4+T細(xì)胞能夠識(shí)別癌抗原，而被激活的M1巨噬細(xì)胞可以抑制腫瘤生長[33]。本研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)CXC趨化因子與六種免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞）的浸潤程度具有相關(guān)性，表明CXC趨化因子的表達(dá)差異對(duì)GBM的免疫微環(huán)境具有影響，并調(diào)控腫瘤的免疫狀態(tài)，為腫瘤發(fā)生和癌癥治療的免疫機(jī)制提供新的見解和思路。但是轉(zhuǎn)錄組水平的分析并不能完全解釋免疫組成和免疫狀態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，僅能體現(xiàn)細(xì)胞的整體水平，因此還需要更多的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證此結(jié)果。

綜上所述，我們通過分析CXC趨化因子對(duì)GBM患者的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)CXCL3/8能夠作為GBM患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。此外，根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析結(jié)果，提示CXC趨化因子在GBM免疫治療方面也具有研究價(jià)值。轉(zhuǎn)錄因子和激酶靶點(diǎn)的分析預(yù)測(cè)則為進(jìn)一步研究CXC趨化因子在GBM中的作用機(jī)制提供了參考，期望以上分析結(jié)果能夠?yàn)镚BM治療提供新的免疫治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物，幫助臨床醫(yī)生為GBM患者選擇合適的治療方案。