王海月,彭 玲,毛念佳,耿金菊,任洪強(qiáng),許 柯

三價(jià)鐵對(duì)有機(jī)物存在下厭氧氨氧化脫氮的影響

王海月,彭 玲,毛念佳,耿金菊,任洪強(qiáng),許 柯*

(南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源再利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

考察了三價(jià)鐵(2.24~7.84mg/L)存在下厭氧氨氧化系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物的耐受性能,并通過(guò)16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)和定量PCR探究其機(jī)理.結(jié)果表明,進(jìn)水COD濃度為50和100mg/L時(shí),4個(gè)反應(yīng)器的氨氮和總氮去除率均較高(>90%),三價(jià)鐵的強(qiáng)化作用不明顯;進(jìn)水COD濃度繼續(xù)升高(150和200mg/L),厭氧氨氧化受到抑制,三價(jià)鐵的強(qiáng)化作用逐漸增加;COD濃度為200mg/L時(shí),添加三價(jià)鐵(7.84mg/L)可將氨氮和總氮去除率由61.3%和79.8%(對(duì)照組)提升至71.2%和84.7%.16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)表明,有機(jī)物存在下,污泥微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,主要表現(xiàn)為厭氧氨氧化菌豐度的降低及反硝化菌群的大量增殖,進(jìn)水添加三價(jià)鐵可提高浮霉菌(Planctomycetes)的豐度.定量PCR結(jié)果表明, 三價(jià)鐵能夠提高厭氧氨氧化菌16S rRNA及功能基因的豐度.

三價(jià)鐵；生物脫氮；厭氧氨氧化；厭氧顆粒污泥膨脹床；COD

厭氧氨氧化(Anammox)可在厭氧條件下實(shí)現(xiàn)氨氮和亞硝酸鹽的同時(shí)去除,相較于傳統(tǒng)硝化反硝化工藝,具有節(jié)省60%曝氣消耗,無(wú)需外加有機(jī)碳源,減少90%污泥產(chǎn)生量等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)得到廣泛關(guān)注[1-2].

迄今為止,全世界已建立了200多個(gè)基于Anammox工藝的全規(guī)模污水處理廠[3].Anammox工藝主要適用于處理低碳氮比的高氨氮廢水[4],而實(shí)際廢水中含有濃度,種類不同的有機(jī)物質(zhì)[5],通常認(rèn)為有機(jī)物的存在會(huì)對(duì)厭氧氨氧化菌產(chǎn)生負(fù)面影響[6-8].在Anammox系統(tǒng)中,脫氮性能取決于厭氧氨氧化和反硝化的競(jìng)爭(zhēng)共存,但是,由于反硝化反應(yīng)在熱力學(xué)上比厭氧氨氧化反應(yīng)更有利,以及厭氧氨氧化菌的低生長(zhǎng)速率和低產(chǎn)率,在有足夠化學(xué)需氧量 (COD)的系統(tǒng)中很難維持厭氧氨氧化菌的高豐度,從而影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性[9].相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)水COD濃度約為280mg/L時(shí)會(huì)完全抑制厭氧氨氧化過(guò)程[6].因此,為避免有機(jī)負(fù)荷過(guò)大,通常在主流厭氧氨氧化工藝中采取有機(jī)碳分離預(yù)處理措施.例如,以混合厭氧反應(yīng)器(HAR)作為預(yù)處理捕集COD并進(jìn)行資源回收[10],但低溫和低底物濃度會(huì)阻礙厭氧預(yù)處理的應(yīng)用.由此可見,當(dāng)前的研究重點(diǎn)是提高Anammox工藝自身耐受有機(jī)物的性能,開發(fā)可行有效的新技術(shù)至關(guān)重要.

鐵作為含鐵蛋白的組成部分,在微生物的代謝和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用[11].鐵元素可能影響厭氧氨氧化菌的代謝,Van Niftrik等[12]發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌體內(nèi)含有鐵儲(chǔ)存顆粒.研究表明,在合理的Fe2+和Fe3+濃度下,Anammox的活性可以通過(guò)維持較高的氧化還原電位和聚集酰基-高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)來(lái)增強(qiáng),而AHLs被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要物質(zhì)[13].Wang等[14]發(fā)現(xiàn)添加到聚乙烯醇/殼聚糖/鐵凝膠珠中的鐵離子與帶負(fù)電的細(xì)胞外聚合物之間的相互作用可以提升Anammox生物質(zhì)顆粒的致密性,從而有效地提高反應(yīng)器中的生物質(zhì)保留能力,保護(hù)細(xì)胞抵御外部壓力.Yin等[15]報(bào)道添加Fe3+(5mg/L) 促進(jìn)了海洋厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)速度,從而實(shí)現(xiàn)了更高的總氮去除率.此外,研究發(fā)現(xiàn)Fe3+濃度從2.24mg/L增加至5.6mg/L時(shí),厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)速率從0.1343d-1增加到0.1709d-1[16].然而,關(guān)于Fe3+對(duì)有機(jī)物存在下厭氧氨氧化系統(tǒng)的脫氮規(guī)律變化及污泥微生物群落動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)道尚少,且Fe3+對(duì)相關(guān)氮素轉(zhuǎn)化功能基因的長(zhǎng)期影響仍不清楚.

本文系統(tǒng)考察了三價(jià)鐵存在下厭氧氨氧化系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物的耐受性能,闡述了三價(jià)鐵對(duì)厭氧氨氧化工藝運(yùn)行中氮素轉(zhuǎn)化,污泥活性的影響,分析了微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及相關(guān)氮素轉(zhuǎn)化功能基因的表達(dá).通過(guò)這些研究,為三價(jià)鐵強(qiáng)化厭氧氨氧化工藝提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)采用厭氧膨脹床反應(yīng)器(EGSB),EGSB反應(yīng)器能使微生物有效持留,并使污泥流態(tài)化,促進(jìn)基質(zhì)傳遞及產(chǎn)氣釋放.此外,維持污泥膨脹所進(jìn)行的出水回流,可削弱基質(zhì)自抑制效應(yīng),非常適于厭氧氨氧化工藝的啟動(dòng)及運(yùn)行.實(shí)驗(yàn)采用的ESGB反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成,其高徑比為6,有效容積為0.8L.模擬廢水由蠕動(dòng)泵泵入反應(yīng)器,在升流運(yùn)動(dòng)中完成氮素轉(zhuǎn)化,氣體由頂部的氣室排出,出水由溢流堰排放.反應(yīng)器出水回流比為8,液面上升速度為0.1m/h,為防止光的負(fù)面影響,反應(yīng)器外裹錫紙.實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示.

實(shí)驗(yàn)采用4個(gè)完全一致的EGSB反應(yīng)器,編號(hào)R1,R2,R3,R4,其中R1為對(duì)照組,R2,R3,R4為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)水添加三價(jià)鐵濃度分別為2.24,4.48,7.84mg/L,以氯化鐵形式提供.模擬廢水pH值調(diào)節(jié)在6.7~6.8,曝高純氮?dú)?>99.5%)至溶解氧(DO)低于0.5mg/L后,進(jìn)入密封進(jìn)水箱.反應(yīng)器連續(xù)進(jìn)水,溫度通過(guò)夾套層控制在(35 ± 1)℃.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意

1.2 接種污泥與實(shí)驗(yàn)進(jìn)水

試驗(yàn)污泥取自于南京大學(xué)污染控制與資源再利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的具有良好厭氧氨氧化性能的污水處理反應(yīng)器,污泥含量為3.65g VSS/L.穩(wěn)定運(yùn)行后反應(yīng)器引入有機(jī)物(葡萄糖),并加入三價(jià)鐵.實(shí)驗(yàn)采用模擬廢水,氮素以硫酸銨及亞硝酸鈉提供,濃度按需配制.模擬廢水組分如表1所示,為滿足微生物生長(zhǎng)要求,模擬廢水中加入1.25mL/L微量元素濃縮液,組分參考已發(fā)表文獻(xiàn)[17].

表1 模擬廢水組分

1.3 分析項(xiàng)目與檢測(cè)方法

1.3.1 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定與分析 采集進(jìn)水和出水水樣,經(jīng)0.45μm玻璃纖維膜過(guò)濾后進(jìn)行分析.NH4+-N, NO2--N,NO3--N,COD采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定(APHA 1998).溶解氧(DO) ,pH值采用便攜式溶氧儀(HQ40d, HACH, America and PB-10, Sartorius, Germany)和pH計(jì)(FE20, METTLER TOLEDO Inc., USA)測(cè)定.

氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率參照式1,2,3計(jì)算.

式中:(Inf.NH4+),(Eff.NH4+),(Inf.NO2-),(Eff.NO2-),(Inf.TN),(Eff.TN)分別代表進(jìn)出水中氨氮,亞硝酸鹽及總氮濃度,mg/L.

1.3.2 微生物特性指標(biāo)檢測(cè) (1)比厭氧氨氧化活性(SAA)測(cè)定:從反應(yīng)器中取一定量污泥加入100mL血清瓶中,使瓶?jī)?nèi)VSS為2.0g/L,加入NH4+-N及NO2--N濃度分別為70和92mg/L的模擬廢水80mL,通入高純氮(>99.5%)15min,保證其無(wú)氧環(huán)境.血清瓶置于恒溫振蕩器中,溫度設(shè)定為35℃.用注射器間隔取樣,測(cè)定血清瓶中NH4+-N,NO2--N和NO3--N濃度以確定比厭氧氨氧化活性.(2)氮素轉(zhuǎn)化功能基因及功能菌豐度測(cè)定:取定量污泥,使用試劑盒FastDNATMSpin Kit for soil提取DNA.定量PCR分析選取細(xì)菌16S rRNA,厭氧氨氧化菌16S rRNA及相關(guān)氮素轉(zhuǎn)化功能基因.引物選取參考已發(fā)表文獻(xiàn)[17],并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.反應(yīng)體系為25μL,包括:12.5μL的2×EasyTaq?PCR SuperMix,2μL DNA模板(稀釋至20ng/μL),正反向引物各1μL(20μM)及8.5μL的ddH2O,擴(kuò)增程序循環(huán)數(shù)為25.定量PCR擴(kuò)增在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀AB7500(Life Technologies,美國(guó))上進(jìn)行.(3)微生物群落結(jié)構(gòu)分析:取適量污泥樣品,用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒進(jìn)行DNA提取.采用細(xì)菌通用引物對(duì)污泥樣品DNA進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增,引物序列及擴(kuò)增體系參考已發(fā)表文獻(xiàn)[17].混合4份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit試劑盒進(jìn)行純化,送至江蘇中宜金大分析檢測(cè)有限公司進(jìn)行分析.所有測(cè)序數(shù)據(jù)均已上傳至Figshare平臺(tái),DOI為10.6084/ m9.figshare.12850043,各樣品的序列信息見表2.

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA,置信水平95%),<0.05 視為具有顯著性影響.采用Canoco 軟件進(jìn)行冗余分析(RDA),進(jìn)一步分析細(xì)菌群落相對(duì)豐度和功能基因及功能菌豐度與環(huán)境因子間的相關(guān)性.

表2 樣品序列信息

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)物存在下的進(jìn)出水水質(zhì)

反應(yīng)器中污泥含量為3.65g VSS/L.運(yùn)行前20d,各組反應(yīng)器平行運(yùn)行.20d達(dá)到穩(wěn)定,進(jìn)水添加三價(jià)鐵和有機(jī)物,有機(jī)物按50,100,150,200mg/L COD梯度同步提高.0~60d進(jìn)水氨氮及亞硝酸鹽濃度分別穩(wěn)定為152.5,200mg/L.出水氨氮,亞硝酸鹽,硝酸鹽濃度及其去除率如圖2所示.

由圖2可知,反應(yīng)器R1在20~30d時(shí),平均氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率分別提高為95.5%,98.1%及95.1%,相較于未添加有機(jī)物,總氮去除率明顯提高;30~40d時(shí),COD濃度提高為100mg/L,反應(yīng)器氮素去除率仍較高;進(jìn)水COD提高為150mg/L時(shí)(40~50d),反應(yīng)器中氨氮去除率降低至83.2%,平均亞硝酸鹽及總氮去除率分別為97.5%及89.6%;而當(dāng)進(jìn)水COD進(jìn)一步提升至200mg/L 時(shí)(50~60d),氨氮去除率下降為61.3%,亞硝酸鹽平均去除率為97.3%,總氮去除率下降為79.8%,出水pH值為8.3 ± 0.2,幾乎超過(guò)厭氧氨氧化菌最適生長(zhǎng)pH值范圍.

有機(jī)物存在下,實(shí)驗(yàn)組R2,R3,R4呈現(xiàn)出與R1類似的運(yùn)行特征,但由于進(jìn)水三價(jià)鐵添加量的不同,反應(yīng)器在不同階段運(yùn)行效能存在一定差異.R2,R3, R4中在同一時(shí)段氮素去除率高于R1.當(dāng)COD濃度提升至200mg/L時(shí), R2,R3,R4的氨氮去除率分別為63.0%,68.2%,71.2%;總氮去除率分別為80.5%, 82.9%,84.7%.

圖2 有機(jī)物存在下出水氮素濃度及其去除率

(a) R1; (b) R2; (c) R3; (d) R4;上方濃度為COD梯度,下同

厭氧氨氧化反應(yīng)器為混菌系統(tǒng).胡勇有等[18]發(fā)現(xiàn)葡萄糖存在下厭氧氨氧化菌與反硝化菌協(xié)同脫氮適宜的COD與氨氮的比值在0~1.57;Winkler等[19]認(rèn)為在進(jìn)水的C/N比小于0.5時(shí),厭氧氨氧化菌能勝過(guò)異養(yǎng)反硝化菌.在本實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)水COD濃度為50,100mg/L時(shí),各反應(yīng)器中氮素去除率提升明顯,此時(shí)厭氧氨氧化作用起主導(dǎo)作用,反硝化菌協(xié)同降解厭氧氨氧化反應(yīng)產(chǎn)生的硝酸鹽,提高了總氮去除率,其他研究也觀察到了類似現(xiàn)象[6].而COD濃度提升為150mg/L時(shí),出水中氨氮濃度明顯提升,這一現(xiàn)象,在進(jìn)水COD濃度升高為200mg/L時(shí)更明顯,此時(shí)COD與氨氮比值為1.32,出水氨氮濃度顯著升高,同時(shí)亞硝酸鹽及硝酸鹽去除效果明顯,主要的脫氮途徑從厭氧氨氧化轉(zhuǎn)變?yōu)榉聪趸?厭氧氨氧化活性降低的一種可能解釋是,在高有機(jī)物含量下,異養(yǎng)反硝化菌將以更快的速率生長(zhǎng),厭氧氨氧化菌在與反硝化菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間和亞硝酸鹽(電子受體)時(shí)占劣勢(shì),同時(shí)反硝化過(guò)程使pH值升高,可能超出厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)范圍[20].朱葛夫等[21]采用 CSTR 反應(yīng)器研究了以異養(yǎng)反硝化污泥啟動(dòng)厭氧氨氧化系統(tǒng)的可行性,并指出系統(tǒng)的最適C/N比為2.14,與本研究結(jié)果有明顯不同,這可能與采用的反應(yīng)器載體,接種污泥的來(lái)源有關(guān),推測(cè)是電子受體競(jìng)爭(zhēng)而不是COD濃度本身導(dǎo)致了厭氧氨氧化活性降低.

在進(jìn)水存在有機(jī)物的條件下,由于實(shí)驗(yàn)組中三價(jià)鐵的加入,反應(yīng)器在整體運(yùn)行中的氮素轉(zhuǎn)化呈現(xiàn)出一定的不同.在同一時(shí)段,實(shí)驗(yàn)組中氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率略高于對(duì)照組R1,這在R3,R4中體現(xiàn)得更為明顯.有研究表明,三價(jià)鐵作為酶的常見活性劑,有可能提高微生物代謝活性,促進(jìn)其生長(zhǎng)[22],實(shí)驗(yàn)組中較高的氮素去除率,可能因?yàn)槿齼r(jià)鐵的添加,提高了反硝化菌及厭氧氨氧化菌的活性.

2.2 污泥比厭氧氨氧化活性

為探究有機(jī)物存在下污泥活性的變化,選取各反應(yīng)器20,30,40,50,60d時(shí)的污泥,測(cè)定其比厭氧氨氧化活性,其結(jié)果如圖3所示.

各反應(yīng)器運(yùn)行至20d時(shí),由于接種污泥相同且同步運(yùn)行, SAA幾乎一致.20d時(shí)進(jìn)水加入葡萄糖,COD濃度為50mg/L.運(yùn)行至30d時(shí),各反應(yīng)器污泥SAA分別為106.5,115.2,118.6,118.2mg N/(g VSS·d).由出水水質(zhì)可得,由于反應(yīng)器中反硝化作用,總氮去除率有一定升高,同時(shí)厭氧氨氧化活性并未受到抑制,氮素去除效果較好. 40d時(shí), R2,R3,R4污泥SAA分別比R1高7.9,11.9,13.8mg N/(g VSS·d),說(shuō)明添加三價(jià)鐵提高了污泥厭氧氨氧化活性.

圖3 有機(jī)物存在時(shí)各反應(yīng)器污泥比厭氧氨氧化活性的變化

當(dāng)進(jìn)水COD濃度為150和200mg/L時(shí),各反應(yīng)器污泥SAA明顯下降,實(shí)驗(yàn)組中污泥SAA高于對(duì)照組,60d時(shí),R1,R2,R3,R4污泥SAA分別為46.8,48.5, 50.3,52.4mg N/(g VSS·d),可推斷出在高有機(jī)物濃度下,三價(jià)鐵的添加可以提高厭氧氨氧化污泥的活性,增強(qiáng)污泥的有機(jī)物耐受能力.

由圖3可知,無(wú)論進(jìn)水COD濃度如何,同一時(shí)間點(diǎn)各反應(yīng)器中污泥SAA均與三價(jià)鐵添加量呈現(xiàn)出一定的正相關(guān), SAA高低順序?yàn)?R4 > R3 > R2 > R1,與各反應(yīng)器氮去除率結(jié)果一致.

2.3 微生物群落變化

由于厭氧氨氧化反應(yīng)器為混菌系統(tǒng),研究有機(jī)物存在下污泥微生物群落的變化,可從微觀層面上解釋三價(jià)鐵對(duì)厭氧氨氧化運(yùn)行過(guò)程的影響.本研究選取16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu),比較有機(jī)物存在時(shí)不同三價(jià)鐵添加量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,探討微生物群落結(jié)構(gòu)變化與脫氮效能之間的關(guān)系.

2.3.1 有機(jī)物存在下細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)變化 圖4為有機(jī)物存在下反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)門水平分布圖.由圖4得,20d時(shí)各反應(yīng)器中污泥微生物群落結(jié)構(gòu)接近一致,變形菌(Proteobacteria)和綠彎菌(Chloroflexi)為優(yōu)勢(shì)菌門,其豐度分別為34.72%~ 35.25%及19.60%~20.38%.據(jù)報(bào)道,主要的反硝化微生物屬于變形菌(Proteobacteria)[23].綠彎菌(Chloroflexi)可支持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性,并且可以在缺氧條件下清除源自厭氧氨氧化菌的代謝產(chǎn)物[24].放線菌(Actinobacteria)及擬桿菌(Bacteroidetes)在各反應(yīng)器中也有一定比例.此外,各反應(yīng)器中與厭氧氨氧化菌相關(guān)的浮霉菌(Planctomycetes)豐度接近,為5.52%~5.54%,這與其他厭氧氨氧化反應(yīng)器的報(bào)道相似[4].

圖4 有機(jī)物存在下污泥中門水平優(yōu)勢(shì)菌分布

經(jīng)歷有機(jī)負(fù)荷沖擊后,60d時(shí)反應(yīng)器中門水平群落結(jié)構(gòu)變化明顯. R1,R2,R3,R4中變形菌(Proteobacteria)豐度分別提升至40.16%,39.69%, 44.25%,43.67%;綠彎菌(Chloroflexi)則分別下降至13.53%,10.66%,6.21%,6.23%;放線菌(Actinobacteria)及擬桿菌(Bacteroidetes)均有一定增長(zhǎng).門水平上浮霉菌(Planctomycetes)明顯減少,這種變化也類似于處理高濃度COD廢水的其他厭氧氨氧化菌反應(yīng)器[4].但各反應(yīng)器中浮霉菌(Planctomycetes)減少的程度不同,R1,R2,R3,R4中浮霉菌(Planctomycetes)豐度分別降至1.83%,2.16%,2.24%,2.45%.結(jié)果表明,浮霉菌(Planctomycetes)豐度與所添加三價(jià)鐵濃度呈正相關(guān)性(2=0.962,<0.05),而所有已確認(rèn)的厭氧氨氧化菌均屬于浮霉菌(Planctomycetes)門,其豐度可反映厭氧氨氧化菌的生存狀態(tài)[5],可以推斷三價(jià)鐵的添加促進(jìn)了厭氧氨氧化菌的富集生長(zhǎng).

2.3.2 有機(jī)物存在下細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)變化 圖5為有機(jī)物存在下污泥屬水平下優(yōu)勢(shì)菌群分布變化.是具有厭氧氨氧化能力的優(yōu)勢(shì)屬,但其豐度隨著進(jìn)水COD的升高而降低,這在R1,R2中體現(xiàn)的更為明顯. 60d時(shí),各反應(yīng)器中其豐度分別為0.83%,0.93%,1.03%,1.13%,可見三價(jià)鐵添加的實(shí)驗(yàn)組中菌富集效果更好,這與反應(yīng)器SAA及運(yùn)行效能一致.可以推斷,在一定濃度范圍內(nèi),厭氧氨氧化菌的富集效果與進(jìn)水鐵離子添加量呈正相關(guān)(2=0.994,<0.01).

圖5 有機(jī)物存在下污泥中屬水平優(yōu)勢(shì)菌分布(> 0.1%)

圖6 環(huán)境因子與屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群間RDA分析

有機(jī)物存在下,反硝化菌屬,豐度明顯增加.在20d時(shí),幾乎難以檢測(cè)到屬,而在60d時(shí),各反應(yīng)器中屬豐度分別提升為2.43%,2.52%,2.89%,3.12%,與對(duì)照組R1相比,添加三價(jià)鐵的反應(yīng)器中屬豐度較高.反硝化菌屬于-變形菌, 20d時(shí),各反應(yīng)器中其豐度為0.23%~0.53%,而運(yùn)行至60d時(shí),其在各反應(yīng)器中豐度分別提升至4.28%, 4.53%,4.59%,5.34%.說(shuō)明COD的存在使反硝化菌得以生存和占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位.

運(yùn)用Canoco 4.5軟件,將細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度與環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(圖6).

由圖6可看出,20d時(shí),各反應(yīng)器無(wú)明顯差異,而運(yùn)行60d時(shí),表現(xiàn)出明顯差異,表明三價(jià)鐵的添加對(duì)有機(jī)物存在下細(xì)菌群落影響較大.厭氧氨氧化菌和一些反硝化菌屬,與SAA以及氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率呈正相關(guān),與進(jìn)水COD呈負(fù)相關(guān).而其余反硝化菌屬,,,則相反,即與進(jìn)水COD呈正相關(guān),與SAA以及氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率呈負(fù)相關(guān).表明COD抑制了Anammox過(guò)程,而三價(jià)鐵可以通過(guò)促進(jìn)豐度的增加,進(jìn)而促進(jìn)氨氮,亞硝酸鹽和總氮的去除.

2.4 功能基因及功能菌豐度變化

本研究中,有機(jī)物存在下反應(yīng)器污泥細(xì)菌16S rRNA,厭氧氨氧化菌16S rRNA,氮素轉(zhuǎn)化功能基因及豐度如圖7所示.

圖7 有機(jī)物存在下amoA基因,hzsB基因,細(xì)菌及厭氧氨氧化菌16S rRNA 豐度變化

(a)細(xì)菌16S rNRA;(b)厭氧氨氧化菌16S rRNA;(c)基因;(d)基因; “*”表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異顯著(<0.05)

運(yùn)行至60d時(shí),各反應(yīng)器中細(xì)菌16S rRNA含量分別為3.67×107,3.80×107,4.01×107,4.12×107拷貝數(shù)/ng DNA,反應(yīng)器R3,R4中豐度顯著高于對(duì)照組R1(<0.05), R3,R4中較多的微生物量或是因?yàn)槿齼r(jià)鐵的添加.

20d時(shí),各反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因豐度幾乎一致;運(yùn)行至40d時(shí),由于低濃度有機(jī)物的促進(jìn)作用,各反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因豐度有所提升,R3,R4中豐度顯著高于R1(<0.05),且豐度與三價(jià)鐵添加量呈現(xiàn)出一定的正相關(guān).隨著進(jìn)水COD進(jìn)一步提高,由于較高濃度有機(jī)物下反硝化菌的競(jìng)爭(zhēng)作用,厭氧氨氧化菌含量均有不同程度下降,實(shí)驗(yàn)組中豐度均高于對(duì)照組R1(<0.05).可以發(fā)現(xiàn),厭氧氨氧化菌的豐度與厭氧氨氧化菌的活性有很強(qiáng)的相關(guān)性,這與前人的研究一致[25],因此實(shí)現(xiàn)良好的厭氧氨氧化菌保留率可能是在污水處理系統(tǒng)中增強(qiáng)Anammox的關(guān)鍵.

厭氧氨氧化功能基因豐度變化與厭氧氨氧化菌16S rRNA基因變化趨勢(shì)一致,均先增加而后減少.同一時(shí)間,R2,R3,R4中的豐度顯著高于R1(<0.05).

由于反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中嚴(yán)格的條件控制,功能基因在運(yùn)行過(guò)程中含量幾乎保持穩(wěn)定,反應(yīng)器R1中其豐度為5.00×102~8.60×102拷貝數(shù)/ng DNA, R2中其豐度保持在5.50×102~1.13×103拷貝數(shù)/ng DNA,R3,R4中其豐度則分別為4.50×102~8.00×102拷貝數(shù)/ng DNA,5.00×102~6.50×102拷貝數(shù)/ng DNA.

如前所述,有機(jī)物添加使得厭氧氨氧化反應(yīng)器中反硝化菌增長(zhǎng),而整體氮素脫除,依賴于厭氧氨氧化菌及反硝化菌的共同作用.為探究此過(guò)程中反硝化作用的變化,選取4種反硝化功能基因,,,測(cè)定,其結(jié)果如圖8所示.

由圖8得,存在有機(jī)物時(shí),反硝化功能基因,,,的豐度隨著COD的增加而增加,這與前人的研究一致[26].

運(yùn)行至60d時(shí),基因的豐度在各反應(yīng)器中分別提高至2.13×106,2.65×106,2.76×106,3.01×106拷貝數(shù)/ng DNA,實(shí)驗(yàn)組R2,R3,R4中豐度顯著高于R1(< 0.05).及也呈現(xiàn)類似的變化規(guī)律,說(shuō)明三價(jià)鐵的添加顯著提高了反硝化功能基因的豐度.

功能基因及功能菌豐度與環(huán)境因子的冗余分析見圖9.

圖8 有機(jī)物存在下反硝化功能基因豐度變化

(a)基因;(b)基因;(c)基因;(d)基因; “*”表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異顯著(<0.05)

圖9 環(huán)境因子與功能基因及功能菌豐度間RDA分析

由圖9可看出,20d時(shí),R1,R2,R3,R4無(wú)明顯差異,而運(yùn)行60d時(shí)差異明顯,表明三價(jià)鐵的添加使各反應(yīng)器之間功能基因及功能菌豐度的差異變大.厭氧氨氧化菌16S rRNA和厭氧氨氧化功能基因的豐度均與SAA以及氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率呈正相關(guān),與進(jìn)水COD呈負(fù)相關(guān),這也進(jìn)一步驗(yàn)證了當(dāng)COD濃度較高時(shí),厭氧氨氧化菌及厭氧氨氧化功能基因受到抑制,氨氮,亞硝酸鹽及總氮的去除率下降.而功能基因的豐度與SAA以及氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率,進(jìn)水COD之間均無(wú)明顯相關(guān)性.反硝化功能基因,,,的豐度與進(jìn)水COD呈正相關(guān),與SAA以及氨氮,亞硝酸鹽及總氮去除率呈負(fù)相關(guān),這也進(jìn)一步驗(yàn)證了有機(jī)物的添加可以提高反硝化功能基因的豐度.

3 結(jié)論

3.1 在高濃度的有機(jī)物(200mg/L COD)下,與空白組相比,投加7.84mg/L Fe3+可使氨氮和總氮去除率分別提高9.9%和4.9%.

3.2 有機(jī)物存在下,污泥微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,表現(xiàn)為厭氧氨氧化菌豐度的降低及反硝化菌屬,豐度的提升.同一有機(jī)物濃度下,添加三價(jià)鐵組的污泥微生物的豐度更高.

3.3 厭氧氨氧化菌16S rRNA及基因豐度在一定范圍內(nèi)與三價(jià)鐵添加量呈正相關(guān).

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Effect of Fe3+on nitrogen removal of Anammox in the presence of organic matter.

WANG Hai-yue, PENG Ling, MAO Nian-jia, GENG Jin-ju, REN Hong-qiang, XU Ke*

(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China)., 2021,41(4)：1672~1680

The tolerance of Anammox to organic matter in the presence of Fe3+(2.24~7.84mg/L) was investigated by running four reactors (R1control, R2 2.24mg/L Fe3+, R3 4.48mg/L Fe3+, R4 7.84mg/L Fe3+). The mechanism was clarified by using 16SrRNA high-throughput sequencing technology and qPCR. The results showed that high NH4+-N and TN removal rates (> 90%) of all four reactors could be achieved at the influent COD concentration of 50 and 100mg/L, and the presence of Fe3+did not show the obvious positive effect. As the influent COD concentration increased to 150 and 200mg/L, the performance of Anammox was inhibited and the positive effect of Fe3+increased. When the influent COD concentration was 200mg/L, the addition of Fe3+(7.84mg/L) increased the NH4+-N and TN removals from 61.3% and 79.8% (R1) to 71.2% and 84.7%, respectively. 16SrRNA high-throughput sequencing results indicated the decrease of Anammox bacteria and the proliferation of denitrifying bacteria in the presence of organic matter. The presence of Fe3+could increase the abundance of Planctomycetes. Fe3+had promoting effects on the abundance of Anammox 16S rRNA and functional geneby qPCR data analysis.

Fe3+；biological nitrogen removal；Anammox；expanded granular sludge bed (EGSB)；COD

X703

A

1000-6923(2021)04-1672-09

王海月(1997-),女,新疆伊犁人,南京大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)槲鬯锩摰?

2020-07-27

水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2017ZX07202003)

* 責(zé)任作者, 副教授, kexu@nju.edu.cn