孫 明，李 唐，趙小明，閻圣剛，尹 恒

（1.大連海事大學(xué)交通運輸工程學(xué)院，大連116026；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所遼寧省碳水化合物重點實驗室天然產(chǎn)物與糖工程研究組，大連116023）

褐藻多糖作為一種天然多糖，具有藥物制劑輔料所具備的安全性、溶解性、穩(wěn)定性和黏性［1］；其也可以作為主要添加劑［2］，廣泛用于糖果、冷凍甜食及其他食品芯、餡的制作中。褐藻多糖是由β?D?甘露糖醛酸（β?D?mannuronate，M）和其C5差向異構(gòu)體α?L?古羅糖醛酸（α?L?guluronate，G）兩種單體組成的線型聚合物。在褐藻多糖中，M和G的存在形式可能有3種：聚甘露糖醛酸片段（M?blocks）、聚古羅糖醛酸片段（G?blocks）和甘露糖醛酸?古羅糖醛酸混合片段（MG?blocks）。褐藻多糖和寡糖中不同的M/G 比值使其具有不同的空間結(jié)構(gòu)［3］和功能［4］，如富含M 的褐藻多糖和寡糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用［5?6］，而富含G 的褐藻多糖易與二價陽離子Ca2+形成凝膠［7?8］，因凝膠具有一定的穩(wěn)定形狀，從而成為良好的藥物載體（圖1）。

圖1 甘露糖醛酸C?5差向異構(gòu)酶的功能以及海藻酸與Ca2+的結(jié)合方式Figure 1 The function of mannuronan C?5 epimerase and the way of combining alginate with Ca2+

許多棕色固氮菌屬（Azotobacter Vinelandii）和假單胞菌屬（Pseudomonas）可產(chǎn)生胞外褐藻多糖，在其生物體內(nèi)首先合成聚甘露糖醛酸片段（M?blocks），然后在甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶作用下，部分甘露糖醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣帕_糖醛酸［9］（圖1）。目前研究發(fā)現(xiàn)，棕色固氮菌屬編碼7 個胞內(nèi)（algE1?algE7）［11］和1 個周質(zhì)（al?gG）甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶的基因［12］。與之不同的是，假單胞菌屬中僅編碼一個甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶基因（algG）［10］，卻同樣可以完成同棕色固氮菌屬相同的功能，但對其功能的了解相對不明晰。選取來自Pseudomonas syringae 的單模塊周質(zhì)酶Al?gG_PSEAM 作為研究對象，通過對其晶體結(jié)構(gòu)進行分析，探究loop439?455對其酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

HITACHI 高速離心機；Bio Tek 全波長酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；高分辨核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl 5 g/L，121 ℃條件下滅菌20 min。降至室溫加入氨芐青霉素，至終濃度為100 μg/mL。

DNS（3，5?二硝基水楊酸）配制：將酒石酸鉀鈉溶于70 ℃熱水中，加入DNS 和NaOH 溶液；再加入重蒸酚和亞硫酸鈉，攪拌溶解，得到DNS 試劑。NaOH 溶液的濃度為2 mol/L；DNS 試劑中，酒石酸鉀鈉的占比（W/V）為18.2%；DNS 的占比（W/V）為0.63%；NaOH 溶液的體積分數(shù)為26.2%；重蒸酚的占比（W/V）為0.5%；亞硫酸鈉的占比（W/V）為0.5%。

1.2 蛋白表達與純化

在北京中美泰和生物技術(shù)有限公司進行目的基因AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體的合成并成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PET21a 中。按照E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化操作說明書，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布在加有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h 后，挑取單克隆接種于10 mL LB（含100 μg/mL 氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h 后接入1 L LB（含100 μg/mL 氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600值0.6 左右，加入異丙基?β?D?硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.1 mmol/L，16 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。

8 000 r/min 離心10 min，收集細胞，用結(jié)合緩沖液（50 mmol/L MES pH 6.4；500 mmol/L NaCl；5%甘油；2 mmol/L MgSO4；1 mmol/L PMSF）重懸細胞，超聲破碎（200 W、30 min）后12 000 r/min離心20 min，收集上清液，0.2 μm 濾膜過濾后，將上清液加到結(jié)合緩沖液（50 mmol/L MES pH 6.4；500 mmol/L NaCl；5%甘油；2 mmol/L MgSO4）平衡過的鎳柱中（填充物為鎳?瓊脂糖凝膠）結(jié)合15 min 后，放掉上清液，再用含有0、10 和40 mmol/L 咪唑的緩沖液（50 mmol/L MES pH 6.4；500 mmol/L NaCl；5%甘油；2 mmol/L MgSO4）漂洗柱子3 次，之后用洗脫緩沖液（50 mmol/L MES pH 6.4；500 mmol/L NaCl；5%甘油；2 mmol/L MgSO4；200 mmol/L 咪唑）洗脫，收集洗脫液，采用BCA 法測定蛋白含量，每一步采集樣品用于十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）檢測。

1.3 1H NMR 檢 測AlgG_PSEAM 及 其loop439?455 截 短 體的C?5差向異構(gòu)酶活性

取5 μg 酶和5 mg 的褐藻多糖于1 mL pH 8.0 緩沖液中混合，40 ℃反應(yīng)20 min，沸水煮10 min終止反應(yīng)。然后冷凍干燥后加入0.5 mL 氘代重水，進行1H NMR檢測。檢測條件：脈沖程序為zg30，測試溫度為70 ℃，掃描寬度為5 000 Hz，掃描延遲為2 s，掃描次數(shù)為64次。

1.4 DNS 法檢測AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體的裂解酶活性

取5 μg 酶和5 mg 的褐藻多糖于1 mL pH 8.0 緩沖液中混合，40 ℃反應(yīng)40 min，沸水煮10 min 終止反應(yīng)。然后12 000 r/min 離心1 min，取96 μL 反應(yīng)液，加入128 μL DNS，沸水煮10 min，冷卻至室溫加入1.376 mL 水。混勻后取200 μL 加 入96 孔板 中，用酶標(biāo)儀測波長540 nm 測出吸光度值，以Al?gG_PSEAM 對應(yīng)的吸光度值為對照，測出其loop439?455截短體的相對活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AlgG_PSEAM的氨基酸序列分析

采用軟件Mega 7.0 對該類異構(gòu)酶進行序列比對，結(jié)果（圖2）顯示，所有的甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶均含有l(wèi)oop 序列，且催化氨基酸DPHD（E）高度保守［10］。

進一步利用軟件PyMOL對蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖3 所示。AlgG_PSEAM 采用右手平行β?螺旋折疊，與最初發(fā)現(xiàn)的Erwinia chrysanthemi 中的果膠裂解酶結(jié)構(gòu)一致。AlgG_PSEAM 的平行β?螺旋結(jié)構(gòu)包括11個完整線圈和1 個不完整的線圈。由圖3 可知，每個線圈由3 個β 型折疊片PB1、PB2 和PB3 組成，并且通過匝T1（在PB1 和PB2 之間）、T2（在PB2 和PB3 之間）和T3（在PB3 和PB1 之間）連接在一起［10］。通過圖3（b）可看出，AlgG_PSEAM 形成一個凹槽，可容納底物并對其進行催化。在這個凹槽中，loop439?455的存在似乎限制了槽口的大小，對底物的進入起到阻礙作用，進而限制了催化活性。因此通過基因手段除去loop439?455，試圖將凹槽入口變大，加強酶對底物的催化作用。

圖2 甘露糖醛酸C?5差向異構(gòu)酶氨基酸序列比對圖Figure 2 The amino acid sequence comparison of mannuronan C?5 epimerase

圖3 AlgG_PSEAM 的整體結(jié)構(gòu)Figure 3 Overall structure of AlgG_PSEAM

2.2 AlgG_PSEAM及其loop439?455截短體的表達純化

通過基因合成，得到了完整的AlgG_PSEAM 基因序列以及缺失氨基酸序列439-455 IKDLNDT?DRDIELDPFD 所對應(yīng)的基因序列的截短體。將攜帶質(zhì)粒PET21a?AlgG_PSEAM 和PET21a?loop439?455截短體的重組大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)0.1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達后，經(jīng)鎳柱純化并將蛋白濃縮至0.5 mg/mL，其SDS?PAGE 電泳結(jié)果如圖4 所示。可以看出該酶在大腸桿菌中能夠大量可溶性表達，重組蛋白也能夠結(jié)合鎳柱，一步純化后就可以得到純度較高的酶，根據(jù)測序得到的氨基酸計算可知，其中AlgG_PSEAM 為54.89 ku，其loop439?455截短體為52.87 ku。

2.3 AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體C?5 差向異構(gòu)酶活性測定

圖4 甘露糖醛酸C?5差向異構(gòu)酶純化結(jié)果Figure 4 Results of purification of mannuronan C?5 epimerase

酶與底物反應(yīng)適當(dāng)時間后，通過1H NMR 測定G含量的變化并以此評估C?5異構(gòu)酶的活性。按照Gras?dalen 等［14］計算單體G（FG），M（FM）以及FGG、FMM、FGM、FMG、FGGG、FMGM、FGGM和FMGG的摩爾分數(shù)方法計算得到G 含量的變化。如圖5 所示，截去loop439?455后，與Al?gG_PSEAM 對比，截短體C?5 差向異構(gòu)活性提高了14.7%。loop439?455被去除后，凹槽的入口可能因此變大，有利于甘露糖醛酸片段的進入以及與酶的結(jié)合。另外當(dāng)古羅糖醛酸含量增加后，褐藻多糖的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，底物的空間形狀變大，更加不利于進入凹槽與酶發(fā)生作用，而loop439?455的去除可能解決了該問題。Maika 等［15］正是利用了該思路，通過高通量篩選，鑒定了來自Vibrio fluvialis 的胺轉(zhuǎn)氨酶（ATA）突變體。該突變體使酶具有較寬的底物結(jié)合口袋，可以允許2，2?二甲基?1?苯丙?1?胺的不對稱合成，這是任何野生型的ATA 都無法實現(xiàn)的。所以拓寬底物結(jié)合口袋對酶的功能以及活性具有較大的影響。

圖5 AlgG_PSEAM及其截短體對海藻酸鹽孵育前后的1H NMR譜圖Figure 5 1H NMR spectra of alginates before and after incubation with AlgG_PSEAM and its truncation

2.4 AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體裂解酶功能發(fā)現(xiàn)及活性測定

隨著反應(yīng)時間的延長，出現(xiàn)了一些端基峰△?1?M，△?1?G，Mred 和Gred，具體如圖5。已有研究表明，褐藻多糖裂解酶通過β?消除反應(yīng)降解特定序列的海藻酸鹽，可以產(chǎn)生不飽和非還原端4?脫氧?L?赤?己?4?烯吡喃糖基脲酸酯（△）和飽和還原端Mred 和Gred［16］。由此可知，AlgG_PSEAM 還具有海藻酸鹽裂解酶的功能。

按照Miller 等［17］描述的方法，通過3，5?二硝基水楊酸（DNS）分析檢測，再次對裂解酶功能進行測定。實驗結(jié)果表明，褐藻多糖與AlgG_PSEAM 作用后，隨著時間的延長，還原糖的含量不斷增加，因此證明了裂解酶功能的存在。圖6顯示，截去loop439?455后，褐藻多糖裂解酶的活性提高了23.3%，說明loop439?455的存在也限制了AlgG_PSEAM的裂解酶活性。

圖6 AlgG_PSEAM及其截短體的裂解酶及其異構(gòu)酶活性Figure 6 The lyase and epimerase activity of AlgG_PSEAM and its truncation

迄今為止，關(guān)于具有多功能特性的甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶的報道依舊較少。AlgG_PSEAM 具有褐藻多糖裂解酶活性的生物學(xué)意義，可能與其囊腫的形成有關(guān)［18］，在不同的生長時期，菌株或者藻類對褐藻多糖的需求不同。另外部分菌株或者菌株的寄主可能以褐藻多糖為食物，該酶對其進行降解后有利于食者進行消化和吸收［19］。

3 結(jié)論

本實驗以來自Pseudomonas syringae的一種甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體為研究對象，對其氨基酸序列以及晶體結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)loop439?455的存在可能影響了酶與底物的結(jié)合，因此將AlgG_PSEAM 及其loop439?455截短體基因在大腸桿菌中異源表達。通過純化得到了兩個純度較高的酶，測定其異構(gòu)酶活性，發(fā)現(xiàn)loop439?455失去后，甘露糖醛酸C?5 差向異構(gòu)酶活性得到了提高。意外的是，隨著反應(yīng)時間的延長，該酶顯示出裂解酶活性，并且失去loop439?455后，裂解酶的活性也得到了提高。根據(jù)這兩種現(xiàn)象猜測，可能是由于loop439?455被去除后，反應(yīng)槽的入口因此變大，有利于甘露糖醛酸片段的進入，使得更多的底物與酶進行結(jié)合，從而增加了產(chǎn)物的量。另外當(dāng)古羅糖醛酸含量增加后，褐藻多糖的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，底物的空間形狀變大，loop439?455的去除更加有利于底物的進入并且與酶發(fā)生作用。因此，截去loop439?455可同時提高AlgG_PSEAM 的甘露糖醛酸C?5差向異構(gòu)酶和褐藻多糖裂解酶活性。