張劍邊填軒李輝張炆濤李萌萱

(山東建筑大學(xué) 理學(xué)院，山東 濟(jì)南250101)

0 引言

光學(xué)顯微鏡是由不同焦距的透鏡組合而成的一種光學(xué)系統(tǒng)，豐富了人們對于微觀世界的認(rèn)識，在生產(chǎn)、生活、科研和醫(yī)療等領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。 分辨率和放大率是衡量顯微鏡性能的重要參數(shù)，主要取決于透鏡的焦距。 光學(xué)顯微鏡的極限放大率為1 600 倍，在使用油浸介質(zhì)的情況下達(dá)到2 000 倍，極限分辨率則可達(dá)200 nm[1]。 由于高質(zhì)量的光學(xué)顯微鏡的價格昂貴，因此利用低倍顯微鏡實(shí)現(xiàn)高分辨率和超分辨可以大大降低使用成本。

CHEN 等[2]提出了納米光子噴流的概念，用時域有限差分法計算了當(dāng)平面光束經(jīng)過介電圓柱時的衍射圖像，圓柱的另一側(cè)陰影區(qū)域出現(xiàn)了束腰小于波長的光斑，強(qiáng)度為入射光強(qiáng)的150 倍，傳播大約兩個波長的距離時光斑沒有明顯的衍射，當(dāng)電介質(zhì)圓柱折射率變小時，光斑從圓柱內(nèi)逐漸移動到圓柱表面外側(cè)。 納米光子噴流已應(yīng)用于光學(xué)超顯微[3-4]、微粒操控[5-6]、輔助共聚焦顯微[7]，還可以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)拉曼散射和增強(qiáng)熒光顯微[8]。 科研人員通過改變環(huán)境介質(zhì)折射率[9]和介觀尺寸電介質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)降低納米光子噴流的半峰寬，增加發(fā)射長度和改變光束扭曲程度。 已經(jīng)證明的結(jié)構(gòu)有串聯(lián)微結(jié)構(gòu)[10]、透明介質(zhì)微球埋入透明介質(zhì)立方體結(jié)構(gòu)[11]、蜘蛛絲形成的紡錘結(jié)構(gòu)[12]、雙層透明介質(zhì)微圓柱[13]、雙透明介質(zhì)微半圓柱[14]等，此外雙納米光子噴流也已得到證明[15]。

在光學(xué)超顯微領(lǐng)域，主要討論了尺寸＜50 μm的透明介質(zhì)微球放在樣品表面提高顯微鏡分辨率的作用，微球到樣品的距離和在樣品上的位置都很難控制。 研究人員認(rèn)為納米光子噴流越長，改變微球到樣品的距離時，能夠得到清晰放大圖像的位置就越多[16]。 文章研究了尺寸＞200 μm 透明介質(zhì)微球，其相當(dāng)于短焦距的透鏡，使用光學(xué)平移臺和細(xì)金屬絲可以方便地改變其位置且操作方便。 應(yīng)用幾何光學(xué)可以計算出焦點(diǎn)的位置，通過改變透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)和樣品之間的距離，既可以成實(shí)像也可以成虛像，還可以調(diào)整放大率。 透明介質(zhì)微球體積小，幾十克的微球其數(shù)量可達(dá)到幾千或者幾萬，單個介質(zhì)微球的成本非常低，因此應(yīng)用介質(zhì)微球輔助低倍顯微鏡可提高分辨率和放大率，減少昂貴的高分辨顯微鏡的使用，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。

1 理論分析

波動光學(xué)和幾何光學(xué)都可以用來計算透明介質(zhì)微球的納米光子噴流位置。 當(dāng)球的尺寸與波長相當(dāng)時可用波動光學(xué)，而當(dāng)微球的尺寸遠(yuǎn)大于波長時則可用幾何光學(xué)。 一般認(rèn)為尺寸＞50 μm 的微球的焦點(diǎn)位置的計算可以采用幾何光學(xué)。 在傍軸光線條件下，透明介質(zhì)微球可以看作是厚透鏡，應(yīng)用兩次球面物象折射公式，可以計算出焦點(diǎn)位置。 透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)計算原理如圖1 所示。P為物點(diǎn)，P′、P″分別為經(jīng)過第一、第二個球面成像的像點(diǎn)。n1和n2分別為透明介質(zhì)微球左、右兩邊的介質(zhì)折射率，n為介質(zhì)球的折射率，O和O′分別為左、右球面的中心，S、S″分別為經(jīng)過第一、二個球面成像的物距和像距，S′和S′ -2r為第一、二個球面成像的像距和物距，r為球面半徑。

根據(jù)球面物像折射公式[1]，透明微球的成像規(guī)律由式(1)和(2)表示為

當(dāng)平行光入射時，S ＝∞，因此像距由式(3)～(5)表示為式中f ′為焦點(diǎn)到O′的距離。

當(dāng)n1＝n2時，f ′由式(6)表示為

當(dāng)n1＝n2＝1 時，焦點(diǎn)到球心的距離由式(7)表示為

焦點(diǎn)到微球球面距離與微球半徑比值隨折射率的變化曲線如圖2 所示。 焦點(diǎn)到球面的距離隨著折射率的升高而減小，焦點(diǎn)光斑的半角寬度增加，從而顯微數(shù)值孔徑增加，這是透明介質(zhì)微球能夠提高分辨率的原因之一。 當(dāng)折射率為2 時，焦點(diǎn)落在透明介質(zhì)微球表面；當(dāng)折射率＞2 時，焦點(diǎn)進(jìn)入透明介質(zhì)微球內(nèi)部。

圖2 焦點(diǎn)到微球球面距離與微球半徑比值隨折射率的變化曲線圖

透明介質(zhì)微球的放大率由物距和焦點(diǎn)的位置決定。 成虛像時，放大率由式(8)表示為

式中m為放大率；u為物距。n增加時，f減小，物距不變時，放大率減小；n不變時，物距增加，放大率增加。

成實(shí)像時，放大率由式(9)表示為

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

采用低倍光學(xué)顯微鏡，其目鏡為10 倍，而物鏡分別為4、10、40 倍，光源采用商用發(fā)光二極管(Light Emitting Diode，LED)白光光源。 用膠水將透明介質(zhì)微球固定在細(xì)銅絲的一端，另一端固定于螺旋測微器，調(diào)整螺旋測微器可以改變透明介質(zhì)微球到樣品的距離，距離的精度為10 μm。 用螺旋測微器測量蓋玻片的厚度為170 μm。 樣品有植物根尖永久裝片、洋蔥細(xì)胞永久裝片和臨時裝片。 實(shí)驗(yàn)采用硅膠、玻璃和鈦酸鋇等3 種材料的透明介質(zhì)微球，折射率分別為1.46、1.50 和1.90。 二氧化硅微球的直徑為600～1 000 μm、玻璃微球的直徑為1 000 μm、鈦酸鋇微球的直徑約為200 μm。 透明介質(zhì)微球成像分為:(1)S＜f，成放大的虛像；(2)f＜S＜2f，成放大的實(shí)像；(3) 玻璃微球和硅膠微球?qū)Ρ龋?4) 透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)直徑的測量；(5)光學(xué)超分辨。透明介質(zhì)微球顯微原理如圖3 所示。

圖3 透明介質(zhì)微球顯微原理圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 微球輔助成放大虛像

采用自制洋蔥表皮細(xì)胞裝片作為顯微樣品，樣品放置在蓋玻片上。 顯微圖像如圖4 所示，in為歸一化圖像強(qiáng)度，圖像顯示采用log-log 方式，圖像矩陣均為150 pixel×150 pixel。 10×4 倍(目鏡放大倍數(shù)×物鏡放大倍數(shù))時樣品顯微原圖如圖4(a)所示，細(xì)胞壁和細(xì)胞核都清晰可見。 顯微鏡10×4 倍下加入透明硅膠微球，并且微球與樣品接觸，因此物距為球的半徑，顯微圖像如圖4(b)所示，由于S＜f，因此成放大的虛像。 圖4(c)為顯微鏡10×4 倍下加入透明硅膠微球的顯微圖像，調(diào)整螺旋測微器增加透明硅膠微球和樣品間的距離，使虛像放大倍率最高，加入透明硅膠微球后分辨率和放大率明顯提高。圖4(b)和(c)中的虛線正方形表示細(xì)胞相同的位置，虛線正方形邊長的像素數(shù)分別為12、60 個，說明放大率提高到原來的5 倍。 圖4(d)為10×40 倍顯微原圖，根據(jù)細(xì)胞壁厚度可以判斷圖4(c)和(d)的放大率相當(dāng)，所以圖4(c)的放大率約為400 倍，是沒有透明硅膠微球顯微原圖放大率的10 倍。 4 張圖的圖像強(qiáng)度最大值分別為5.5、4.8、4.2 和90，說明透明硅膠微球?qū)饩€有衰減作用。 微球和樣品距離增加時圖像強(qiáng)度也減小，這是由于光通量降低了，400 倍顯微原圖中物鏡距離樣品最近，通光量也就最大。

圖4 洋蔥細(xì)胞裝片的顯微圖像(虛像)

3.2 微球輔助成放大實(shí)像

3.2.1 微球輔助放大實(shí)像的放大率

采用的透明硅膠微球直徑為860 μm，由式(8)得其焦距f為682 μm，樣品采用根尖細(xì)胞永久裝片。 調(diào)整增加透明硅膠微球和樣品距離，為了保證距離的準(zhǔn)確，在樣品和透明介質(zhì)微球中間放入3 片蓋玻片，永久裝片上封裝樣品還有一片蓋玻片，其厚度為170 μm，所以物距(樣品到微球中心距離)為1 110 μm(4 個蓋玻片厚度加微球半徑)。 在1 倍焦距(682 μm)和2 倍焦距(1 364 μm)之間，成放大的實(shí)像。 根尖細(xì)胞永久裝片顯微鏡原圖如圖5 所示，其中10×10 倍顯微鏡原圖如圖5(a)所示，放入透明硅膠微球的顯微圖如圖5(b)所示。 在兩圖中根尖細(xì)胞相同的位置做線掃描，像素個數(shù)分別為17、47，圖像放大了2.8 倍。

圖5 根尖細(xì)胞永久裝片顯微圖像

3.2.2 微球輔助放大實(shí)像的分辨率

采用透明硅膠微球的直徑為630 μm，由式(8)得其焦距f為500 μm，樣品為洋蔥細(xì)胞永久裝片。在透明介質(zhì)微球和樣品之間放入3 個蓋玻片，加上樣品自帶的蓋玻片，物距為995 μm。 在1 倍焦距(500 μm)和2 倍焦距(1 000 μm)之間，成放大的實(shí)像。 圖6(a)為10×10 倍的洋蔥細(xì)胞顯微原圖，圖6(c)為放入透明硅膠微球后的顯微圖像，在細(xì)胞核的對應(yīng)位置做線掃描(圖中虛線所示)，線掃描的圖像強(qiáng)度分別如圖6(b)和(d)所示，分別有5 和6 個峰值。 圖6(d)提供了更多的信息，圖6(b)中第5個峰值的半峰寬為15 個像素，圖6(d)中第5 和6個峰值的半峰寬為5 個像素，因此有硅膠透明介質(zhì)微球時，圖像分辨率提高了3 倍。 但是有透明硅膠微球時圖像強(qiáng)度有所降低，這使得圖像的襯度降低，并且由于透明硅膠微球的聚焦作用，圖像強(qiáng)度成高斯分布，在圖像中形成了明顯的亮斑，也降低了圖像襯度。

圖6 洋蔥細(xì)胞永久裝片顯微圖像和對應(yīng)位置圖像強(qiáng)度

3.3 玻璃微球和硅膠微球?qū)Ρ?/h3>

玻璃和硅膠的折射率分別為1.50、1.46。 根據(jù)折射率的大小，玻璃微球的分辨率應(yīng)該大于硅膠微球的分辨率。 玻璃微球和硅膠微球的顯微圖像如圖7 所示。 可以看出，圖7(b)顯示了更多的信息，箭頭所示位置的顆粒更加清晰，而圖7(a)圖像模糊。這說明微球的質(zhì)量，像平整程度、內(nèi)部缺陷等因素也會影響圖像的質(zhì)量。

3.4 焦點(diǎn)直徑測量結(jié)果

幾何光學(xué)認(rèn)為光的波長為零，在均勻介質(zhì)中沿著直線傳播，當(dāng)光線經(jīng)過兩種介質(zhì)的分界面時會發(fā)生折射和反射，并改變其偏振面。 由于忽略了衍射效應(yīng)，所以平行光經(jīng)過透明介質(zhì)微球全部匯聚在一點(diǎn)上。 因此，利用幾何光學(xué)方法計算焦點(diǎn)的位置，只能給出焦點(diǎn)到球面的距離，而無法給出焦點(diǎn)光斑的尺寸。 焦點(diǎn)光斑直徑?jīng)Q定了透明介質(zhì)微球成像的分辨率。 進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)測量焦點(diǎn)光斑尺寸測量[17-18]，顯微鏡的像素分辨率與焦點(diǎn)光斑直徑的像素數(shù)相乘就得到焦點(diǎn)光斑的大小。

測量透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)直徑的光路如圖8 所示。 30 mW 的532 nm 綠色激光首先通過中性衰減片，光強(qiáng)衰減，避免顯微鏡互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(Complementary Metal Oxide Semiconductor，CMOS)相機(jī)飽和，然后光束經(jīng)過直角反光鏡射向透明介質(zhì)微球，透明介質(zhì)微球放在蓋玻片上，近似認(rèn)為蓋玻片對激光束波前沒有影響，衍射光束進(jìn)入光學(xué)顯微鏡，顯微鏡放大率為10×4 倍，CMOS 相機(jī)記錄衍射光束。

上下移動顯微鏡物鏡，進(jìn)行連續(xù)拍攝，得到一組衍射光場的二維圖像，用差值法組合成衍射光場的三維圖像。 (1) 粗調(diào)顯微鏡物鏡，找到透明介質(zhì)微球的焦點(diǎn)；(2) 反復(fù)細(xì)調(diào)，中心光斑最小的一張顯示焦點(diǎn)光斑的大小。

圖7 根尖細(xì)胞顯微圖像

圖8 測量透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)直徑光路圖

為了標(biāo)定聚焦條件下CMOS 相機(jī)單個像素的分辨率，先測量銅絲的直徑。 金屬絲的硬度較大，在螺旋測微器夾持下不易發(fā)生形變，不影響測量的準(zhǔn)確性，而透明介質(zhì)微球在螺旋測微器夾持下變形嚴(yán)重，無法用來標(biāo)定顯微鏡。 在銅絲的10 個不同位置用螺旋測微器測量其直徑，聚焦條件拍攝銅絲的顯微圖像，利用MATLAB 軟件對銅絲顯微圖像進(jìn)行顯示，如圖9 所示。 10 個位置測量的銅絲直徑和像素數(shù)結(jié)果見表1，其平均直徑為0.156 mm，銅絲長度平均像素個數(shù)為111.5 個，兩者相除得到CMOS 相機(jī)每個像素的分辨率為1.4 μm。

測量4 個透明介質(zhì)微球的焦點(diǎn)直徑，如圖10 所示。其中，圖10(a)硅膠介質(zhì)微球1的直徑大于圖10(b)硅膠微球2 的直徑。

4 個透明介質(zhì)微球的焦點(diǎn)直徑見表2。 對于透明硅膠球1 和2，球的直徑減小，焦點(diǎn)的直徑也減小；透明玻璃微球焦點(diǎn)最大，并且出現(xiàn)多個強(qiáng)度和大小接近的光斑，散焦嚴(yán)重，這是圖7(a)比(b)模糊的原因。 透明鈦酸鋇微球焦點(diǎn)直徑最小，并且聚焦效果良好。 4 個球中鈦酸鋇微球的分辨率最高。

圖9 銅絲40 倍顯微圖像

表1 銅絲的直徑和像素數(shù)表

圖10 透明介質(zhì)微球衍射圖

表2 透明介質(zhì)微球焦點(diǎn)直徑表

3.5 鈦酸鋇微球輔助超分辨

樣品為孔間距為125 nm 的雙通多孔氧化鋁(Anodic Aluminum Oxide，AAO)模板，電鏡照片如圖11(a)所示，虛線位置可以認(rèn)為是AAO 模板的一個單元，由7 個直徑為125 nm 的微孔組成。 顯微鏡放大率為10×4，采用直徑為200 μm 的鈦酸鋇微球[19]。 將雙通AAO 模板放在載玻片上，用光學(xué)平移臺調(diào)整透明鈦酸鋇微球到AAO 模板的距離，使其與AAO 模板接觸。 在雙通AAO 模板與透明鈦酸鋇微球之間加入異丙醇，得到圖11(a)中虛線位置的顯微圖像如圖11(b)所示，分辨率達(dá)到了125 nm，小于光學(xué)顯微鏡的極限分辨率200 nm。

圖11 雙通AAO 模板電鏡圖和超分辨圖像

4 結(jié)論

通過理論計算和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，主要得到以下結(jié)論:

(1) 透明介質(zhì)微球能夠提高顯微鏡的放大率和分辨率，放大率由焦點(diǎn)和樣品位置決定，分辨率由焦點(diǎn)光斑的位置和直徑?jīng)Q定，而兩者都和微球的大小和折射率有關(guān)；透明硅膠微球的顯微圖像的放大率可以是顯微原圖的10 倍。

(2) 約200 μm 的鈦酸鋇微球可以實(shí)現(xiàn)125 nm的超分辨，因?yàn)槠渲睆捷^大，比幾十μm 的透明介質(zhì)微球操作方便，可以用來組成低價的超分辨系統(tǒng)；單個透明介質(zhì)微球的成本較低，可以用來提高顯微鏡的放大率和分辨率，降低實(shí)驗(yàn)室成本。