吳美嬌，吳有雪，劉 程，田亞晨，方水琴，劉 箐,2*

1.上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266071

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種常見的食源性致病菌，革蘭氏陰性，呈多形態(tài)桿狀或稍彎曲弧狀，廣泛分布于蝦、貝類、魚類及海藻等海產(chǎn)品中，是全球海產(chǎn)品中引起食用者腹瀉的主要原因[1]。其耐熱性弱，在沸水中10 min即可被殺死[2, 3]。食用副溶血性弧菌污染的食物會引起急性病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便等癥狀[2, 4-5]。 因此，研制一種快速檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測方法尤為重要。

目前檢測副溶血性弧菌的方法主要包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法、分子生物學方法和免疫學方法等。微生物培養(yǎng)方法被認為是檢測副溶血性弧菌的“金標準”，主要通過增菌、分離、生化鑒定等步驟進行檢測。也有一些開發(fā)的顯色培養(yǎng)基可以直觀的鑒定出副溶血性弧菌，如科瑪嘉的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基可將副溶血性弧菌和其它海產(chǎn)品中常見的弧菌從菌落顏色上明顯區(qū)分開來[6]。然而，該方法檢測周期長(3 d ～5 d)，工作量大，依賴于有經(jīng)驗的檢驗者，不適于快速檢測的需求。而以分子生物學和免疫學方法為基礎的檢測方法可提供快速可靠的檢測結果，是近年來研究的主要方向。其中分子生物學檢測方法主要包括聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)、實時定量PCR[7]、環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[8]等。該類方法檢測靈敏度高，周期短，但需要專業(yè)的技術人員和儀器設備進行復雜的操作程序，不能滿足方便、輕便的檢測需求。免疫學檢測方法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[9]，該方法是基于抗原與抗體特異性結合的原理對靶標進行特異性檢測，但其靈敏度低，檢測時間長，達不到現(xiàn)場快速檢測的需求。同樣基于雙抗體夾心原理的免疫層析色譜條(Immunochromatographic strip，ICS)[10, 11]，可實現(xiàn)對靶標進行準確、廉價、便攜的現(xiàn)場檢測，因此被廣泛應用于食源性病原體的檢測[12-15]。

影響ICS檢測靈敏度的兩個主要因素是抗體質(zhì)量和抗體標記物材料?？贵w質(zhì)量的好壞直接影響到其是否可用于研制ICS，及其特性。且抗體的純度、特異性、效價、血清交叉反應與ICS的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性息息相關[16, 17]。目前，以副溶血性弧菌為免疫原制備單克隆抗體的報道主要是基于標準菌株的研究，并未見將野生型菌株作為免疫原的報道，其原因可能是標準菌株的源種、血清型等信息較全，易獲得針對特定靶標的單克隆抗體；而野生型菌株是指從自然界中分離得到的沒有發(fā)生基因突變的原始菌株，更能代表微生物的原始狀態(tài)。因此以野生型菌株作為免疫原制備單克隆抗體可能會得到更高的菌株覆蓋率。另一個影響ICS檢測靈敏度的因素是抗體標記物材料的制備和選擇，目前已有多種納米顆粒被用于標記抗體，如膠體金(Colloidal gold，AuNP)[18]、膠體銀[19]、量子點、聚集誘導發(fā)光(AIE)材料[20]等。其中AuNP納米顆粒因其具有易與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，顏色鮮明，且易制備等優(yōu)點，而被廣泛應用于免疫層析試紙條檢測方法中[21]。當AuNP量較少時會導致信號較低，使得顯色較淺而不能被肉眼看到，靈敏度較低[22]。為提高ICS檢測靈敏度，可通過改變AuNP的結構和增大表面積來實現(xiàn)，如徐鵬等[23]使用多支納米顆粒作為抗體標記物檢測赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)，使靈敏度提高了近30倍；羅云波等[24-26]使用納米星，由于其表面積增大，使得檢測農(nóng)藥殘留的靈敏度有了顯著提高。此外，還有帶刺納米顆粒[27]、類似海膽[28-30]等形狀多樣的AuNP，被用于提高試紙條的靈敏度。因此通過改變膠體金的形狀或粒徑大小是提高檢測靈敏度的有效途徑。

本研究中，以野生型副溶血性弧菌(編號：CPBC-vp-0003)為免疫原制備單克隆抗體，通過制備大粒徑的組合膠體金納米顆粒(Composited colloidal gold nanoparticles, CP-AuNP)為抗體標記探針，研制了一種基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條，用于檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌。該方法靈敏度高、特異性強，可為副溶血性弧菌的檢測提供簡便、快速的可視化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤，購于上海某市場。

副溶血性弧菌(野生菌株編號CPBC-vp-0001～0010，與上海海洋大學交換菌株；標準菌株ATCC 17802、ATCC 33847)，大腸埃希氏菌(ATCC 25922)，腸出血性大腸桿菌O157:H7(ATCC 43895、ATCC 43889)，單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC 43251、ATCC 19115、ATCC 19114)，金黃色葡萄球菌(ATCC 29213、ATCC 27660)，福氏志賀氏菌(ATCC 12022)，鮑氏志賀氏菌(ATCC 9207)，鼠傷寒沙門氏菌(CICC 22956)，豬霍亂沙門氏菌(CICC 21493)，甲型副傷寒沙門氏菌(CMCC 50093)，腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)；sp2/0小鼠骨髓瘤細胞為上海理工大學有害微生物危害及控制研究所保藏。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、3% 氯化鈉堿性蛋白胨水、腦心浸液瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(BSA)、50×HAT培養(yǎng)基[次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基喋呤(aminopterin)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)]、 50×HT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷)購買于Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。Taq DNA聚合酶、小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒購買于生工生物工程(上海)股份有限公司；雌性BALB/c小鼠，上海潔思潔實驗動物有限公司。副溶血性弧菌特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其余試劑購自國藥化學試劑有限公司(上海)和生物工程有限公司(上海)。

1.2 儀器與設備

PCR熱循環(huán)儀，美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀，英國Syngene公司；NC膜、樣品墊、結合墊、吸水墊，上海杰一生物科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海藍柏實驗儀器有限公司；磁力加熱攪拌器，鄭州紅巖儀器設備有限公司；SpectraMaxM2酶標儀，美國Molecular Devices公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司，美國；pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1副溶血性弧菌單克隆抗體和CP-AuNP 的制備

副溶血性弧菌單克隆抗體的制備：以野生型副溶血性弧菌免疫BALB/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選產(chǎn)抗體的雜交瘤細胞。獲得雜交瘤細胞系后，采用體內(nèi)誘生法[31]制備腹水，具體方法為：將液體石蠟按0.5 mL/只對小鼠進行腹腔注射致敏，7 d后將雜交瘤細胞按106個/只腹腔注射已致敏小鼠，待小鼠腹腔膨大后無菌收集腹水，間接ELISA法測定腹水抗體效價，小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒鑒定抗體亞型。

CP-AuNP的制備：采用一步還原法制備AuNP顆粒[15, 32]，將制備的AuNP溶液作為金種子溶液，參照種子介導生長法[33]制備CP-AuNP(圖1)。具體方法和原理為：在0.01%的氯金酸溶液中加入2.7 mL的1% 檸檬酸三鈉，此時氯金酸溶液中的Au3+被還原為Au+。然后加入0.6 mL金種子溶液，使Au+粘附在AuNP上。再通過加入1 mL的0.3 mmol/L對苯二酚，將金種子表面的Au+還原為Au，使多個金種子組合在一起，形成形狀各異、表面積較大的CP-AuNP粒子。

圖1 CP-AuNP標記抗體流程及雙抗體夾心試紙條設計原理

1.3.2CP-AuNP標記抗體

影響CP-AuNP標記抗體的因素主要有pH和抗體濃度。因此，分別對這兩個因素進行了優(yōu)化。優(yōu)化最佳pH時，首先在100 μL CP-AuNP溶液中加入不同體積(0 μL、0.3 μL、0.6 μL、0.9 μL、1.2 μL、1.5 μL、1.8 μL、2.1 μL)的0.2 mol/L K2CO3，以此調(diào)節(jié)溶液的pH；充分混勻后，加入過量抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結合。將2.5 μL上述復合物置于結合墊，37 ℃烘干。取100 μL新鮮培養(yǎng)副溶血性弧菌，上樣于試紙條，肉眼觀察試紙上的T線和C線的顏色。當混合物的pH為抗體蛋白的等電點略偏堿性(即最適pH)時，抗體蛋白能與膠體金牢固結合[34]，因此T線和C線均顯示強顏色信號；pH不適宜時，T線和C線均不顯示或顯示較弱顏色信號。剩余的復合物溶液加入10 μL 10% 氯化鈉溶液，觀察溶液的顏色變化。選擇幾組顏色最深的置于離心管，1 000r/min離心10 min。將離心管傾斜、倒置，觀察樣品的復溶情況。復溶越好，pH越合適。

優(yōu)化最佳抗體用量時，在100 μL CP-AuNP溶液中加入上述優(yōu)化的最佳K2CO3添加量(最佳pH)，分別加入相同體積、不同濃度(0 μg/mL、3μg/mL、9 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、24 μg/mL、36 μg/mL、72 μg/mL、96 μg/mL)的單克隆抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結合。后續(xù)操作如pH優(yōu)化，結合復溶性及微孔的顏色、T線及C線顯色情況，確定最佳抗體使用量。

CP-AuNP標記抗體的方法如下：將最優(yōu)濃度的單克隆抗體滴加(40 μL/min)到最佳pH條件下的CP-AuNP溶液中，4 ℃下攪拌30 min。然后加入1/10 CP-AuNP溶液體積的pH 7.8的磷酸緩沖(PB)溶液(含10% BSA、)，持續(xù)攪拌1 h。1 000r/min離心10 min，棄沉淀；上清再經(jīng)12 000 r/min離心10 min，去除上清液。沉淀重懸于1/10 CP-AuNP溶液的金標抗體保存液中，4 ℃保存。

1.3.3CP-AuNP試紙條的制備和抗體最佳配對的優(yōu)化

CP-AuNP試紙條由NC膜、結合墊、樣品墊、吸水墊及PVC底板五部分組成[14, 35-36]。將制備的單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(1.0 mg/mL)通過點樣儀以1.0 μL/cm的速度分別噴在NC膜的T線和C線處，置室溫過夜干燥。用CP-AuNP-Ab溶液浸泡處理過的結合墊，37 ℃干燥。待結合墊和NC膜干燥后，如圖1，進行組裝。

抗體最佳配對的優(yōu)化：雙抗體夾心試紙條中包含了CP-AuNP結合的捕獲抗體和在NC膜上T線處的檢測抗體，這一對抗體均需能與靶標結合，才能實現(xiàn)雙抗體夾心方法檢測靶標的目的。因此，我們將制備的多株抗體按照兩兩組合的方式分別與CP-AuNP結合和直接噴在NC膜的T線位置，晾干后組裝試紙條。通過驗證不同配對抗體試紙條的靈敏度和特異性情況，選擇最佳配對抗體。

1.3.4CP-AuNP試紙條的靈敏度和特異性驗證

靈敏度驗證：將新鮮培養(yǎng)的野生型副溶血性弧菌，用3%氯化鈉堿性蛋白胨水梯度稀釋成不同濃度，分別取100 μL，用CP-AuNP試紙條進行測試，并用平板計數(shù)法進行計數(shù)。

特異性驗證：對實驗室保藏的12株副溶血性弧菌(10株野生型菌株和2株標準菌株)和14株常見的其它食源性致病菌(見表1)驗證CP-AuNP試紙條的特異性。

1.3.5CP-AuNP試紙條實際檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

對5種海產(chǎn)品(梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤)進行副溶血性弧菌檢測。具體處理方法為：按國標(GB4789.7-2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》)中的培養(yǎng)方法，每一種樣品稱取25 g培養(yǎng)于225 mL 3% 氯化鈉堿性蛋白胨水中，在37 ℃，150 r/min培養(yǎng)18 h后進行試紙條檢測，同時進行PCR驗證(以tlh基因為靶標，參考文獻中報道的引物序列[37]：F：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCAC-TG-3’， R：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’。反應體系為：10 μL 2×Taq Master Mix，1 μL模板，7 μL 去離子水，正反引物各1 μL。反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(30 個循環(huán))；72 ℃ 7 min。目標片段大小為450 bp)。另外，對上述樣品檢測結果陰性的樣品進行人為添加低濃度的野生型副溶血性弧菌，在37 ℃，150r/min培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時取增菌液處理后進行試紙條檢測。

表1 交叉反應結果

2 結果與討論

2.1 副溶血性弧菌單克隆抗體性能

以野生型副溶血性弧菌為免疫原，最終獲得3株單克隆抗體: 1A、2E、4G。通過抗體亞型鑒定，1A為IgG1亞類，2E、4G為IgG3亞類?？贵w效價檢測結果： 1A (2.381 mg/mL)效價為1∶8 000, 2E (7.862 mg/mL)效價為1∶128 000, 4G (3.872 mg/mL)效價為1∶64 000。本實驗也同時用副溶血性弧菌標準株(ATCC 17802、ATCC 33847)作為免疫原，但未能獲得性能較好的抗體。

2.2 CP-AuNP納米顆粒的表征

金納米粒子的尺寸和形狀對試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性非常重要。TEM結果顯示(圖2a和b)，合成的膠體金納米粒子(金種子)呈相對均勻的球體，而CP-AuNP為圓柱體；通過紫外吸收光譜檢測(圖2c)，金種子的最大吸收峰為526 nm，CP-AuNP吸收峰在523 nm～538 nm之間。與AuNP相比，CP-AuNP具納米顆粒的尺寸更大。更大的尺寸可能會降低抗體結合時產(chǎn)生的空間位阻效應，結合更多的抗體，從而提高檢測靈敏度。

(a) AuNPs的TEM圖，(b) CP-AuNPs的TEM圖，(c) AuNP和CP-AuNP的UV-Vis光譜圖。圖2 AuNPs與CP-AuNPs的表征

2.3 CP-AuNP標記抗體條件優(yōu)化和最佳抗體配對情況

經(jīng)方法1.3.2的優(yōu)化，最終得到CP-AuNP標記抗體的最佳pH為8.3(3 μL 0.2 M K2CO3/mL CP-AuNP溶液)、抗體的最佳濃度為45 μg/mL。通過方法1.3.3的優(yōu)化，得到最佳的檢測抗體為2E，最佳捕獲抗體為4G。

2.4 CP-AuNP試紙條的靈敏度、特異性和交叉反應結果

2.4.1靈敏度

在本研究中，為了測試試紙條的靈敏度，采用不同濃度梯度的菌懸液(105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL和101CFU/mL)，以3%氯化鈉蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照，分別取100 μL上樣于試紙條。結果如圖3所示。該CP-AuNP試紙條檢測副溶血性弧菌的檢測限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測限(105-7CFU/mL)[38]，表明CP-AuNP作為標記探針可以提高檢測靈敏度。

圖3 靈敏度測定

2.4.2特異性和交叉反應結果

由圖4顯示，本方法可以檢出實驗室保藏的6株野生型菌株(共10株)，但未檢出副溶血型弧菌標準株(ATCC 17802和ATCC 33847)?？赡茉蚴菢藴示暝诘蜏乩鋬霰４孢^程中導致?lián)p傷，使其抗原表位結構發(fā)生變化而無法和抗體進行結合；而且副溶血性弧菌受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變，也是導致抗體和抗原不能結合的原因之一[39-41]。為了驗證試紙條的交叉反應情況，選擇了常見的14株病原微生物進行驗證，結果見表1，表明該試紙條的特異性較強，與常見病原微生物無交叉反應。

圖4 12株副溶血性弧菌CP-AuNP試紙條檢測結果(注:空白為3%氯化鈉堿性蛋白胨水)。

2.5 CP-AuNP試紙條在實際樣品檢測中的應用

為考察海產(chǎn)品中副溶血性弧菌原始污染的情況，本實驗對5種海產(chǎn)品(梅子魚、鮮蝦、蟶子、花蛤和白蛤)取樣25 g，按照國標方法進行增菌培養(yǎng)，然后對增菌液同時進行CP-AuNP試紙條和PCR檢測。由圖5結果顯示，經(jīng)18 h增菌后，本方法在蟶子和花蛤樣品中檢出副溶血性弧菌，和PCR方法結果一致。說明本方法檢測準確度高。梅子魚、鮮蝦和白蛤樣品經(jīng)過培養(yǎng)后沒有檢出副溶血性弧菌，表明這三種樣品沒有被污染副溶血性弧菌，結果也同PCR檢測結果一致。

圖5 試紙條在海產(chǎn)品中的應用

另一方面，考慮到國標方法中檢測周期長，不適用于快速監(jiān)測海產(chǎn)品污染狀況。因此，在上述增菌后沒有檢出的樣品中(梅子魚、鮮蝦和白蛤)通過人為添加低濃度(1 CFU/mL)的副溶血性弧菌，經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水中進行增菌培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時取增菌液經(jīng)行試紙條檢測。結果表明(圖6)，在增菌4 h后，均可在三種樣品中檢出副溶血性弧菌，相比于國標方法，本方法大大縮短了檢測周期。

圖6 人工污染海產(chǎn)品試紙條檢測結果

3 結論

本研究以野生型副溶血性弧菌為免疫原，共獲得3株單克隆抗體。并通過一步還原法和介導生長法制備了CP-AuNP標記探針，優(yōu)化CP-AuNP標記條件和試紙條最佳抗體配對組合后，并構建了基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速可視化方法。該方法，能檢出6株野生型副溶血性弧菌，檢出限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測限(105-7CFU/mL)，與常見的食源性致病菌無交叉反應。在實際樣品檢測中，對5種海產(chǎn)品直接增菌培養(yǎng)18 h后在蟶子和花蛤中檢出了副溶血性弧菌，表明這兩種海產(chǎn)品存在副溶血性弧菌污染風險，檢測結果與PCR結果一致；在未存在原始污染的其余三份樣品，通過人工污染，按國標方法增菌培養(yǎng)4 h后即可檢出副溶血性弧菌，極大的縮短了檢測周期。表明該方法可應用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測，是一種高靈敏度、高特異性、準確、有效、快速可視化的診斷工具。