高 璐 許文亮

脯氨酸羥化酶GhP4H2在棉花纖維發(fā)育中的功能研究

高 璐1,2許文亮1,*

1華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430079;2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所, 山西臨汾 041000

阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP)在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。AGP由富含羥脯氨酸的主鏈蛋白和大量II型阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)側(cè)鏈組成, 其合成過(guò)程要經(jīng)歷2次翻譯后修飾, 首先是氨基酸主鏈上的脯氨酸被脯氨酸羥化酶(prolyl-4-hydroxylases, P4H)羥基化, 隨后在糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases, GT)催化作用下將阿拉伯半乳聚糖或寡糖添加到羥脯氨酸殘基上。我們前期利用P4Hs的抑制劑處理棉花離體胚發(fā)現(xiàn), 棉纖維伸長(zhǎng)受到抑制, 暗示P4H參與棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。為深入研究P4H在棉纖維發(fā)育中的功能, 我們從棉花中分離鑒定了1個(gè)在棉纖維發(fā)育過(guò)程中高量表達(dá)的脯氨酸羥化酶基因。本研究分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)和RNA interference (RNAi)載體, 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花, 獲得轉(zhuǎn)基因植株, 發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花株系T1~T3代成熟棉纖維變短, AGP含量增加, AG多糖側(cè)鏈也發(fā)生變化。對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株棉纖維的轉(zhuǎn)錄組分析表明, G正調(diào)控包括AGP在內(nèi)的細(xì)胞壁糖蛋白基因的表達(dá)。基于以上研究, 我們推測(cè)可能主要通過(guò)影響AGP糖鏈組分調(diào)控棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育。

棉纖維; 阿拉伯半乳聚糖蛋白; 脯氨酸羥化酶

棉花作為世界上最大的纖維作物和紡織工業(yè)原料, 品質(zhì)是其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要考量因素。棉纖維是由棉花胚珠外珠被表皮層的單細(xì)胞發(fā)育而成, 是自然界最長(zhǎng)的單細(xì)胞之一。細(xì)胞壁作為棉纖維的重要組分, 其合成過(guò)程直接決定著棉纖維的品質(zhì)參數(shù)[1], 它是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu), 由90%高分子量的多聚物和少量糖蛋白組成[2]。雖然糖蛋白組分占比很少, 卻是細(xì)胞壁形態(tài)構(gòu)成和功能發(fā)揮的重要因子。富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins, HRGP)代表細(xì)胞壁糖蛋白的一個(gè)大家族, 根據(jù)其核心蛋白的糖基化程度, 可分為高度糖基化的阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP), 中度糖基化的伸展蛋白(extensins, EXT)以及輕度糖基化的富含脯氨酸蛋白(proline-rich proteins, PRPs) 3類[3-5]。PRP廣泛存在于不同作物中且功能不等, 如參與玉米胚的發(fā)育[6-7]、響應(yīng)大豆干旱和鹽脅迫應(yīng)答[8]等。我們前期從棉花cDNA文庫(kù)中分離了3個(gè)PRP家族基因, 命名為、和, 發(fā)現(xiàn)在下胚軸和根中高量表達(dá),在棉花開花后10 d (days post anthesis, DPA)胚珠中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[9]。在擬南芥中表達(dá)基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽和ABA的敏感性[10]。RNAi轉(zhuǎn)基因棉纖維的長(zhǎng)絨和短絨均增長(zhǎng), 酵母雙雜交表明, GhPRP5可形成同源和異源二聚體發(fā)揮功能, 推測(cè)通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞壁的合成從而影響棉纖維的發(fā)育[11]。AGP可能是自然界中翻譯后修飾程度最高的蛋白, 其合成過(guò)程包括N末端信號(hào)肽序列的切割、由脯氨酸羥化酶(prolyl 4-hydroxylases, P4Hs)催化的脯氨酸殘基的羥基化、GPI錨的修飾和羥脯氨酸殘基上的阿拉伯半乳聚糖糖基化。它是一類O-糖基化蛋白, O-糖基化部位主要發(fā)生在含有絲氨酸(Ser)和羥脯氨酸(Hyp)的肽鏈中[12], 廣泛參與細(xì)胞膨脹、細(xì)胞分化、生殖發(fā)育、體細(xì)胞胚胎發(fā)育、木質(zhì)部分化、非生物脅迫應(yīng)答、激素信號(hào)應(yīng)答等過(guò)程[5]。AGP功能的發(fā)揮很大程度上依賴于占到整個(gè)分子量90%以上的糖側(cè)鏈[13], 擬南芥突變體中AGP分子的糖側(cè)鏈缺失巖藻糖, 使得根長(zhǎng)明顯變短[14]。在中, TTS蛋白參與花粉管的伸長(zhǎng), 但去糖基化的TTS蛋白喪失該功能[15]。近年來(lái), 已經(jīng)篩選出大量編碼AGP合成的基因, 根據(jù)核心蛋白中氨基酸的組成, AGP可分為典型性和非典型性兩大類, 成束蛋白樣阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan proteins, FLAs)作為典型性AGP的代表, 廣泛存在于擬南芥[16]、水稻[17]、小麥[18]、毛果楊[19]、大麻[20]、陸地棉[21]、海島棉[22]等多種植物中。我們之前從棉花中分離了19個(gè)編碼FLA的基因, 其中的3個(gè)()在10 DPA纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn), 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)而抑制表達(dá)減緩了纖維起始和伸長(zhǎng)。免疫組學(xué)分析顯示,影響AGP組分尤其是AG多糖側(cè)鏈的合成[21]。隨后, 我們又分離了糖基轉(zhuǎn)移酶基因GT31家族成員, 發(fā)現(xiàn)其參與AGP (主要是FLA) II型AG糖鏈β-1,3-半乳糖苷鏈的合成, 通過(guò)調(diào)控的表達(dá), 導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系棉纖維細(xì)胞壁的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[23]。綜上, AGP多糖側(cè)鏈在棉纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用, 但對(duì)于催化脯氨酸羥基化的脯氨酸羥化酶在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的作用還不清楚。

P4H是普遍存在于動(dòng)物和植物中的一種2-氧化戊二酸雙加氧酶, 主要定位于內(nèi)膜系統(tǒng), 其功能的發(fā)揮需要Fe2+、α-酮戊二酸、O2等的參與[24]。動(dòng)物等高級(jí)生物中P4H分為兩大類, 影響膠原蛋白合成的C-P4H和缺氧誘導(dǎo)HIF-P4H。C-P4H是膠原蛋白合成的關(guān)鍵因子, 這類P4H以α2β2四聚體結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能, β-基序形成二硫鍵異構(gòu)酶, α-基序則形成催化亞基, 催化底物氨基酸序列-X-Pro-Gly-中的Pro羥基化[25-26]。目前植物中關(guān)于P4H的報(bào)道還較少, 與動(dòng)物中C-P4H不同的是其只含有α催化亞基, 催化底物中位于Ala、Gln、Hyp、Pro、Ser、Thr和Val之后的Pro羥基化, 但位于其他氨基酸之后的第1個(gè)Pro不能被羥基化。P4H催化的底物EXT中的Pro為連續(xù)的2~4個(gè)單元, 并且始終毗鄰Ser(Ser-(Pro)2-4), 羥基化后形成Ser-(Hyp)2-4。當(dāng)AGP作為催化底物時(shí), AP/PA/SP/TP重復(fù)序列是其羥基化的敏感位點(diǎn)。而PRPs的PPVX [KT]、KKPCPP和PPV序列以及其他富含Pro的嵌合蛋白XPnY基序是其催化的靶序列。光譜測(cè)定和生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到了擬南芥中AtPRP4 (富含32.5% Pro)、At1g09750、At1g31580 (含27%~28% Pro)、At3g08030、At2g10940 (含6%~8% Pro)催化底物序列Pro的定位, 證明了Pro羥基化序列的多樣性和特異性[27]。萊茵衣藻中共有10個(gè)基因, 但只有的功能得到證實(shí), 缺陷型導(dǎo)致細(xì)胞壁的合成受阻[28]。

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 目前關(guān)于棉花中的報(bào)道還尚屬空白。P4H功能的發(fā)揮離不開保守殘基與2-氧戊二酸鹽(2-oxoglutarate)和Fe2+的結(jié)合。3,4-二羥基苯甲酸乙酯(ethyl-3,4-dihydroxybenzoate, EDHB)和α,α-聯(lián)吡啶(α,α-Dipyridyl, DP)是P4H酶的2種抑制劑, EDHB可以特異結(jié)合2-oxoglutarate, DP則通過(guò)螯合Fe2+抑制P4H酶活[29]。我們前期用不同濃度梯度的EDHB和DP處理棉花離體胚珠后, 棉纖維伸長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制, 且抑制程度與抑制劑濃度呈正相關(guān), 說(shuō)明參與棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育[12]。隨后, 我們從棉花基因組中識(shí)別了30個(gè)可能編碼P4H的基因, 許多P4H家族基因在纖維發(fā)育的不同階段高量表達(dá), 進(jìn)一步表明這些基因可能在纖維發(fā)育過(guò)程中起作用。為研究P4H在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的功能, 本研究克隆了一個(gè)在棉纖維伸長(zhǎng)期高量表達(dá)的P4H家族基因, 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花, 獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株, 旨在了解P4H在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的功能, 為棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制提供新的視野。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究選用陸地棉(L.) Corker 312品種為棉花遺傳轉(zhuǎn)化受體。1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)棉花無(wú)菌苗5~6 d, 將棉花下胚軸切成10 mm左右的小段, 并用含有過(guò)量表達(dá)載體或RNAi載體的農(nóng)桿菌LBA4404懸浮液浸染15 min, 然后將外植體轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(不含任何抗生素)在28℃ (16 h光照/8 h黑暗)下共培養(yǎng)2 d, 后續(xù)詳細(xì)繼代培養(yǎng)步驟參照Qin等[23]的方法。獲得的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)移至溫室土壤中用于目的基因的鑒定和遺傳分析。

1.2 棉花基因組DNA提取

取棉花幼苗2 g左右幼葉, 利用CTAB法提取基因組DNA[23]。

1.3 載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)帶有I和I酶切位點(diǎn)的OE引物(表1), 利用Primer STAR高保真酶擴(kuò)增開放閱讀框序列, 連接到克隆載體pSK上, 測(cè)序驗(yàn)證沒有堿基突變后構(gòu)建到表達(dá)載體pBI121上獲得pBI121過(guò)表達(dá)載體。

兩端酶切位點(diǎn)為H I和I的L1引物(表1)擴(kuò)增正義鏈, 酶切位點(diǎn)為I和I的L2引物(表1)擴(kuò)增反義鏈, 正義鏈和反義鏈中間有一個(gè)基因內(nèi)含子(Intron), 兩端酶切位點(diǎn)分別為I和I。將正義鏈-Intron-反義鏈序列構(gòu)建到pBI121質(zhì)粒中, 獲得pBI121RNAi載體[23]。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR

利用TianGen RNA試劑盒提取棉花RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 將各個(gè)樣品的cDNA稀釋到濃度相當(dāng)后對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析[23]。棉花泛素基因(,)作為內(nèi)參, 本研究所用基因RT-PCR引物見表1。

1.5 棉纖維AGP的分離、純化及定量分析

按照Qin等[23]的方法, 取10 g冷凍干燥的10 DPA纖維, 加入液氮研磨成粉末后, 加入10 mL緩沖液(50 mmol L-1Tris-Cl, 10 mmol L-1pH 8.0 EDTA, 0.1% β-巰基乙醇, 1% (w/v) Triton X-100), 4℃孵育3 h。14,000′離心10 min, 取上清加入10 mL乙醇, 4℃孵育過(guò)夜。離心棄上清, 5 mL 50 mmol L-1Tris-Cl重懸沉淀, 冷凍干燥過(guò)夜。350 μL 1% NaCl重懸樣品, 加入350 μL的β-Yariv, 混勻, 4℃過(guò)夜。14,000′離心1 h, 1% NaCl洗滌沉淀3次, 甲醇洗滌沉淀2次去除β-Yariv, 靜置干燥, 加入適量二甲基亞砜至沉淀完全溶解, 加入微量亞硫酸鈉, 再加入適量超純水至溶液呈亮黃色, 溶液過(guò)PD-10柱脫鹽, 所得即為AGP溶液。

AGP濃度測(cè)定按Qin等[23]的方法, 配制濃度為1%瓊脂糖, 0.02% 疊氮鈉(NaN3), 0.15 mol L-1NaCl以及10 μg mL-1β-Yariv的溶液20 mL, 加熱至沸騰, 待瓊脂糖完全融化后, 將混合液倒入培養(yǎng)皿中, 冷卻。用直徑為2 mm的玻璃吸管對(duì)冷卻的凝膠打孔。取1 μL AGP點(diǎn)樣, 均勻點(diǎn)入每個(gè)孔中, 并選擇濃度為0.1~0.6 μg μL-1的阿拉伯樹膠作為標(biāo)樣對(duì)照。將平板置于黑暗潮濕的環(huán)境中過(guò)夜。測(cè)量每個(gè)擴(kuò)散色圈的直徑, 并計(jì)算色圈面積, 根據(jù)標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各個(gè)待測(cè)樣品的濃度。

1.6 Immuno Dot blot分析

根據(jù)Qin等[23]的方法進(jìn)行Dot blot分析野生型與轉(zhuǎn)基因棉花株系中AGP的差異。分別利用JIM8和JIM13作為一抗, 堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(H+L)作為二抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。

1.7 轉(zhuǎn)錄組分析

收取野生型和過(guò)表達(dá)株系5 DPA纖維,利用Spectrum plant total RNA Kit試劑盒提取總RNA, 純化后檢測(cè)RNA的完整性。將完整性好的RNA進(jìn)行RAN-seq (北京諾禾致源基因公司)。GO (Gene ontology)預(yù)測(cè)差異基因功能并分類, 以值為依據(jù), 篩選出差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 GhP4H2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因表達(dá)譜

利用Clustalx、MEGA7.0 (http://www.megasoftware. net/)對(duì)擬南芥P4H與棉花GhP4H2進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖1-A)發(fā)現(xiàn), GhP4H2與AtP4H2、AtP4H4處于同一個(gè)亞支, 親緣關(guān)系最近。

為研究基因在棉花中的表達(dá)模式, 提取棉花的根、下胚軸、子葉、真葉、花瓣、花藥、15 d胚珠及不同發(fā)育時(shí)期纖維的RNA, 逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析?；蛟谧尤~、真葉、花藥中高量表達(dá), 在纖維發(fā)育的不同時(shí)期(0~20 DPA)均有較高水平的表達(dá), 且在5 DPA和9 DPA纖維中保持較高的表達(dá)量(圖1-B), 暗示可能參與棉纖維伸長(zhǎng)過(guò)程。

A: 棉花GhP4H2與擬南芥GhP4H蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系; B:基因在棉花各組織的表達(dá)譜。1: 根; 2: 下胚軸; 3: 子葉; 4: 真葉; 5: 花瓣; 6: 花藥; 7: 15 DPA胚珠; 8: 0 DPA纖維(含胚珠); 9: 3 DPA纖維(含胚珠); 10: 5 DPA纖維; 11: 9 DPA纖維; 12: 15 DPA纖維; 13: 20 DPA纖維。DPA: 開花后天數(shù)。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。

A: phylogenetic relationship of GhP4H2 andP4Hs; B: expression analysis ofin different cotton tissues. 1: root; 2: hypocotyl; 3: cotyledon; 4: leaves; 5: petals; 6: anthers; 7: 15 DPA ovule; 8: 0 DPA fiber (with ovule); 9: 3 DPA fiber (with ovule); 10: 5 DPA fiber; 11: 9 DPA fiber; 12: 15 DPA fiber; 13: 20 DPA fiber. DPA: days post anthesis. Error bar represents the standard deviation.

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花株系中GhP4H2的表達(dá)分析

為研究在棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能, 本研究分別構(gòu)建了由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)(overexpression, OE)和RNA interference (RNAi)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花下胚軸, 獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。取不同轉(zhuǎn)基因株系5 DPA和10 DPA纖維進(jìn)行表達(dá)量鑒定表明,基因在RNAi (Ri)株系L16和L28中表達(dá)量顯著低于WT, 在過(guò)表達(dá)株系L10和L38中表達(dá)量顯著增加(圖2)。我們后續(xù)研究選擇RiL16、RiL28、OEL10、OEL38這4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型分析。

2.3 GhP4H2轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維表型分析

分析T1~T3代成熟纖維表型變化發(fā)現(xiàn), 與野生型相比,過(guò)表達(dá)株系的成熟棉纖維長(zhǎng)度顯著變短, 而RNAi株系沒有明顯變化。脫絨后比較不同株系種子形態(tài)大小, 未發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖3), 表明主要影響纖維發(fā)育而對(duì)胚珠影響較小。

2.4 GhP4H2轉(zhuǎn)基因棉纖維AGP含量分析

考慮到AGP基因數(shù)目占了棉纖維HRGP基因的絕大多數(shù)[23], 我們推測(cè)AGP可能是P4H的首選底物。為研究對(duì)AGP合成的影響, 本研究提取了10 DPA纖維AGP進(jìn)行定量檢測(cè)。以0.1~0.6 μg μL-1濃度梯度的阿拉伯樹膠作對(duì)照, 繪制折線圖并計(jì)算各轉(zhuǎn)基因株系中AGP樣品濃度(圖4)。RiL28中AGP含量明顯低于WT, RiL16中AGP含量有輕微減少; 而過(guò)表達(dá)株系OEL38中含量顯著增加, OEL10中AGP含量有輕微增加, 但未見顯著差異。

2.5 GhP4H2影響AGPs多糖側(cè)鏈的合成

為研究對(duì)AGP糖側(cè)鏈合成的影響, 本研究用不同的抗體進(jìn)行了Dot blot分析。其中, JIM8、JIM13能夠與AGP糖側(cè)鏈抗原決定簇特異性結(jié)合, JIM8特異結(jié)合阿拉伯半乳糖側(cè)鏈, JIM13特異結(jié)合β-GlcA-(1,3)-α-Gal-(1,2)-Rha側(cè)鏈。由圖5可知, RNAi株系雜交信號(hào)與WT相比減弱, 并且JIM8雜交信號(hào)弱于JIM13。過(guò)表達(dá)株系則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系中影響了AGP糖側(cè)鏈的組成。

A:在不同株系5 DPA纖維中表達(dá)分析; B:在不同株系10 DPA纖維中表達(dá)分析。RiL16、RiL28表示2個(gè)獨(dú)立的RNAi株系; WT表示野生型; OEL10、OEL38表示2個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)株系。**表示在0.01水平差異顯著。

A and B: quantitative RT-PCR analysis ofexpression in 5 DPA (A) and 10 DPA (B) fibers from independent transgenic cotton lines and wild type. RiL16 and RiL28 represent two independent-RNAi lines; WT represents the wild type; OEL10 and OEL38 represent two independentoverexpression lines. ** means significant difference at the 0.01 probability level.

A:轉(zhuǎn)基因棉花與WT成熟種子和纖維表型比較; B:轉(zhuǎn)基因棉花與WT成熟纖維長(zhǎng)度比較。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A and B: measurement and statistical analysis of mature fiber length and seed size of the transgenic cotton plants and wild type. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

A: 不同樣品AGP特異反應(yīng)色圈。B: 阿拉伯樹膠標(biāo)準(zhǔn)曲線; 橫坐標(biāo)代表AGP濃度, 縱坐標(biāo)代表對(duì)應(yīng)的色圈面積。C: 不同樣品AGP含量。0.1~0.6 (μg μL-1): 阿拉伯樹膠濃度。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A: halos of different samples from transgenic lines and wild type. B: standard curve; Abscissa: the AGPs concentration; Ordinate: the area of the corresponding halos. C: the AGPs content of different samples from transgenic lines and wild type. 0.1–0.6 (μg μL-1): gum arabic concentration. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

-: PBS陰性對(duì)照。+: 1 mol L-1arabic gum陽(yáng)性對(duì)照。株系名稱縮寫同圖2。

-: PBS negative control. +: 1 mol L-1arabic gum positive control. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

2.6 GhP4H2影響棉纖維細(xì)胞壁相關(guān)基因的表達(dá)

為研究在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控通路, 取野生型和過(guò)表達(dá)株系OEL38的5 DPA纖維進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。本研究主要關(guān)注細(xì)胞壁相關(guān)基因。與WT相比, OEL38株系202個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因中與細(xì)胞壁合成相關(guān)的有15個(gè)(圖6-A), 其中編碼HRGP的基因有8個(gè), 占到細(xì)胞壁基因的53.3%,、屬于AGP類,、屬于EXT類,、、、屬于PRP類。因此推測(cè)這些編碼HRGP的基因很可能是作用的靶基因。選擇這8個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證(圖6-B)發(fā)現(xiàn), 這8個(gè)基因在OEL38中表達(dá)量均顯著升高, 說(shuō)明可能通過(guò)催化這些底物來(lái)調(diào)控棉纖維發(fā)育。

2.7 GhP4H2影響糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GhGalTs)的表達(dá)

我們之前的研究顯示,參與棉纖維發(fā)育過(guò)程[23]。位于下游, 為研究對(duì)表達(dá)的影響, 本研究選擇家族部分基因進(jìn)行表達(dá)分析(圖7)。選擇的7個(gè)基因中有4個(gè)基因(和)在過(guò)表達(dá)株系中的表達(dá)量發(fā)生變化, 表明可能影響了AGP糖基化過(guò)程, 這可能是AGP糖側(cè)鏈發(fā)生改變的原因。

3 討論

先前有研究發(fā)現(xiàn),參與擬南芥低氧應(yīng)答, 過(guò)量表達(dá)致使擬南芥發(fā)生根毛增長(zhǎng), 毛狀體缺失, 種子變小等變化, 同時(shí)導(dǎo)致與缺氧應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)量升高。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,還參與光合作用、JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素調(diào)控等過(guò)程[30]。另外, 有研究表明, AtP4H5分別通過(guò)與AtP4H2和AtP4H13形成異源二聚體發(fā)揮Pro羥基化功能, 并且優(yōu)先羥基化EXT, 三者共同調(diào)控?cái)M南芥根毛的伸長(zhǎng)[31]。敲除會(huì)促進(jìn)番茄根的伸長(zhǎng)和葉子的發(fā)育, 免疫組學(xué)分析顯示, 與JIM8特異性結(jié)合的AGP糖鏈組分缺失[32]。擬南芥和突變體中, 根毛相對(duì)于野生型都變短, DP和EDHB處理也會(huì)抑制根毛的伸長(zhǎng)[31]。前期我們分別用DP和EDHB處理棉花離體胚發(fā)現(xiàn), 棉纖維的生長(zhǎng)發(fā)育受到了明顯的抑制, 推測(cè)參與調(diào)控棉纖維的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。本研究克隆了基因獲得過(guò)表達(dá)和RNAi不同株系轉(zhuǎn)基因棉花, 對(duì)T1~T3代成熟棉鈴進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn),-RNAi株系長(zhǎng)絨與WT相比并沒有明顯變化, 這可能是由于基因功能冗余的原因。而OE株系的成熟纖維明顯短于WT。Dot blot分析顯示, JIM8和JIM13的雜交信號(hào)均增強(qiáng)。我們前期證實(shí)促進(jìn)棉纖維的生長(zhǎng)發(fā)育, 免疫組學(xué)分析顯示,轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)GP側(cè)鏈糖組分發(fā)生不同程度的變化, 其中過(guò)表達(dá)株系中JIM13雜交信號(hào)減弱, 說(shuō)明過(guò)表達(dá)株系中與JIM13特異結(jié)合的AGP表位抗原決定簇減少[21]。隨后我們發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)的棉纖維伸長(zhǎng)受到抑制, 經(jīng)免疫組學(xué)分析, JIM8和JIM13的雜交信號(hào)均增強(qiáng), 表明過(guò)量表達(dá)會(huì)增加與JIM8和JIM13特異結(jié)合的AGP表位抗原決定簇豐度[23]。本研究與過(guò)表達(dá)棉纖維取得的結(jié)果一致, 我們推測(cè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉纖維變短的原因與類似。而在RNAi株系中AGP變化的程度可能不足以明顯影響纖維發(fā)育。前期我們的結(jié)果顯示,正調(diào)控基因的表達(dá)[23], 本研究依據(jù)轉(zhuǎn)錄組及RT-PCR結(jié)果, 證實(shí)篩選到的8個(gè)表達(dá)AGP、EXT、PRP的差異基因受調(diào)控, 可能是其下游靶基因, 后續(xù)又發(fā)現(xiàn)影響下游的表達(dá), 暗示GhP4H2不僅僅影響HRGP羥基化, 對(duì)參與糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)也有影響, 而轉(zhuǎn)基因株系中AGP的變化很可能正是由于GhP4H2與GhGalTs協(xié)同調(diào)控引起。但過(guò)表達(dá)株系成熟纖維表型差異是否與AGP核心蛋白變化有關(guān)？AGP可能是GhP4H2優(yōu)先催化的底物, EXT或PRP也是其作用底物嗎？這些問(wèn)題都有待深入研究。

A: 細(xì)胞壁相關(guān)基因的主要類別; B: 糖蛋白相關(guān)基因的表達(dá)驗(yàn)證。PRP: 富含脯氨酸蛋白; AGP: 阿拉伯半乳聚糖蛋白; EXT: 伸展蛋白; PAL: 苯丙氨酸解氨酶。**表示在0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

A: major classes of the upregulated cell wall genes in transgenic fibers; B: expression analysis of genes encoding glycoproteins. PRP: proline-rich protein; AGP: arabinogalactan protein; EXT: extensin; PAL: phenylalanine ammonia-lyase. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

*、**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。株系名稱縮寫同圖2。

* and ** mean significant differences at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

4 結(jié)論

本研究克隆了一個(gè)脯氨酸羥化酶基因, 該基因通過(guò)影響基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來(lái)影響AGP的合成。過(guò)表達(dá)株系成熟纖維變短與AGP含量增加和糖側(cè)鏈組分改變相關(guān), 而RNAi株系成熟纖維長(zhǎng)度未發(fā)生明顯變化, 可能是由于基因功能冗余導(dǎo)致。推測(cè)過(guò)表達(dá)基因株系出現(xiàn)的表型差異是由AGP糖側(cè)鏈組分變化所致,影響棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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GhP4H2 encoding a prolyl-4-hydroxylase is involved in regulating cotton fiber development

GAO Lu1,2and XU Wen-Liang1,*

1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology / School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, China;2Wheat Research Institute, Shanxi Agricultural University, Linfen 041000, Shanxi, China

Arabinogalactan proteins (AGPs) perform crucial roles during cotton fiber development, and they are composed of a hydroxyproline (Hyp)-rich core protein and large type-II arabinogalactan (AG) moieties. AGPs are highly glycosylated proteins which involve two most important post-translational processes. First, the proline residues were hydroxylated by prolyl- 4-hydroxylases (P4Hs), then the Hyps were substituted with large arabinogalactan polysaccharides or small arabino- oligosaccharides by glycosyltransferases (GTs). Our previous work had shown that fiber elongation was repressed when-cultured cotton ovules were treated with inhibitors of P4Hs, suggesting that P4Hs were involved in cotton fiber development. In this study,was detected to be relatively highly expressed at fiber elongation stage. Overexpression and RNAi-silencing vectors ofwere constructed and transformed into cotton. Phenotypic analysis showed thatoverexpressing fibers were significantly shorter compared with the wild type from T1generation to T3generation. In addition, AGP content had increased inoverexpression fibers. Immuno dot-blot analysis also showed that carbohydrate moieties of AGP had changed. Moreover, RNA-seq revealed that expression levels of genes encoding hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins including AGPs were enhanced. Overall, these results indicated thatmay regulate fiber development primarily through affecting AGPs composition.

cotton fiber; arabinogalactan proteins (AGPs); prolyl-4-hydroxylase (P4Hs)

10.3724/SP.J.1006.2021.04217

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31970516, 31671735)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31970516, 31671735).

許文亮, E-mail: wenliangxu@mail.ccnu.edu.cn

E-mail: 13613418576@163.com

2020-09-22;

2020-12-01;

2020-12-29.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.1747.017.html