龍 鳴，張 棚，劉元林，擺小琴，張福梅，田曉靜，*，曹 竑，周雪雁，馬忠仁，羅 麗，宋 禮， Nurul Izza NORDIN

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124； 2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730030； 3.甘南州牦牛乳研究院，甘肅 合作 747000； 4.Industrial Biotechnology Research Centre， SIRIM Berhad， Shah Alam， Selangor 40700， Malaysia)

乳清蛋白(whey protein)是乳中除酪蛋白外多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、礦物質(zhì)吸收、降低血糖[1]、降低血壓[2]和血脂水平[3]、抑菌[4]、抗癌[5]和抗氧化[6]等功能，可維持機(jī)體健康和修復(fù)損傷，還可提高菌群多樣性，提高或維持腸道益生菌的相對豐度，同時降低腸道有害菌群的豐度[7-8]。作為公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一，乳清蛋白在臨床治療上適用于維持和提高機(jī)體免疫力，抗自由基、延緩人體衰老進(jìn)程，提升腎功能，促進(jìn)傷口愈合等疾病[9-10]。目前，對于乳清蛋白的功能特性研究，主要是通過建立動物模型實驗和人體臨床試驗進(jìn)行探究，對實驗動物的依賴大[11]，為獲取生理生化與形態(tài)學(xué)指標(biāo)需處死實驗動物，與動物保護(hù)主義背道而馳，且分析過程繁瑣，消耗大量人力、物力和財力；因此，對實驗動物實施快速、無創(chuàng)的評價具有重要的科學(xué)意義。

電子鼻(electronic nose，E-nose)利用氣敏傳感器陣列對揮發(fā)性氣味物質(zhì)的響應(yīng)來識別簡單和復(fù)雜氣味信息[12]，已在食品[13]、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[14]中廣泛應(yīng)用。糞便是機(jī)體整體代謝終產(chǎn)物輸出的主要途徑之一，其代謝物的變化不僅能夠反映機(jī)體整體代謝的特征，還是膳食和營養(yǎng)調(diào)節(jié)影響的外在表現(xiàn)[15]。目前，基于代謝物中揮發(fā)性成分呈味電子鼻檢測的研究主要包含食品功能性成分體內(nèi)功效評價及其代謝監(jiān)控等，僅限于針對外部條件對糞便揮發(fā)性代謝物氣味的影響[16-18]、功能成分體內(nèi)評價[19-20]、腸道菌群結(jié)構(gòu)預(yù)測[21]等方面。利用糞便揮發(fā)性氣味物質(zhì)的氣味信息無創(chuàng)評價食品體內(nèi)功能性的研究較少。

本研究旨在探討通過電子鼻監(jiān)測小鼠糞便樣品氣味信息快速無損評價牛乳清蛋白干預(yù)對衰老小鼠的影響，進(jìn)而為基于糞便氣味評價食品功能性奠定基礎(chǔ)。本文以衰老模型小鼠為研究對象，采用電子鼻追蹤牛乳清蛋白干預(yù)小鼠糞便氣味，同時監(jiān)測小鼠體重、周齡；結(jié)合模式識別方法評價氣味信息對小鼠的影響，并建立小鼠體重的定量預(yù)測模型。本研究的結(jié)果可為突破依靠傳統(tǒng)生化指標(biāo)進(jìn)行功效區(qū)分評價的模式提供思路與技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

1.1.2 實驗試劑

D-半乳糖與維生素C(VC)購買自美侖生物，生理鹽水(NS)購買自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，鮮牛乳購于蘭州伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 檢測指標(biāo)

SOD 活性測定采用羥胺法；MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸比色(TBA) 法。體重增長率(%)=(乳清蛋白干預(yù)不同周數(shù)后體重-乳清蛋白干預(yù)前體重)/乳清蛋白干預(yù)前體重×100。胸腺/體重(mg·g-1)=乳清蛋白干預(yù)后胸腺質(zhì)量(mg)/乳清蛋白干預(yù)后體重(g)。

1.1.4 儀器

檢測儀器采用德國AIRSENSE公司的PEN3型便攜式電子鼻。主要包括以下硬件部分：傳感器陣列(包含10個金屬傳感器，其屬性見表1)、采樣與清洗通道、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和計算機(jī)組成。

文中提出一種小尺寸三陷波超寬帶天線，天線的整體尺寸為28 mm×24 mm×1.524 mm，結(jié)構(gòu)簡單，易于加工制作和系統(tǒng)集成。在矩形加等邊梯形的輻射貼片上通過刻蝕U型縫隙，C型縫隙以及增加一對U型旁支結(jié)構(gòu)實現(xiàn)在3.3～3.8 GHz，5～6.1 GHz，7.9～8.8 GHz 3個頻段上的陷波特性，分別有效抑制了WiMAX系統(tǒng)，WLAN系統(tǒng)和ITU信號對于UWB系統(tǒng)的干擾。該天線在整個工作頻段具有輻射特性級增益，符合UWB通信要求，具有很好的研究前景。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

按隨機(jī)數(shù)字表將實驗小鼠分為6組，每組9只小鼠，分組見表2。

1.2.2 牛乳清蛋白制備

鮮牛乳于4 ℃、5 000 r·min-1離心30 min，棄去上層乳脂，脫脂乳在室溫下用1 mol·L-1的HCl調(diào)pH至4.6，40 ℃水浴20 min后于4 ℃、8 000 r·min-1離心20 min，收集上清液。將上清液冷凍干燥，備用。

1.2.3 衰老動物模型制備與牛乳清蛋白抗衰老治療

表1 電子鼻傳感器陣列與性能

表2 動物分組表

對VC組、NS組、CWP-L組、CWP-M組和CWP-H組實驗小鼠，頸背部皮下注射10%D-半乳糖生理鹽水注射液1.25 mg·g-1·d-1，連續(xù)6周制備衰老小鼠。實驗組牛乳清蛋白灌胃給藥按照低(每只100 mg·kg-1·d-1)、中(每只200 mg·kg-1·d-1)、高(每只400 mg·kg-1·d-1)3個濃度梯度；VC陽性對照組按每只300 mg·kg-1·d-1給藥，衰老空白對照組給予同等體積的NS，自然空白組給予同等體積的NS。持續(xù)7周，各組在給藥的同時，持續(xù)給予D-半乳糖生理鹽水頸背部皮下注射。

1.2.4 指標(biāo)檢測

乳清蛋白干預(yù)7周后，檢測體重。小鼠斷頭采血，4 ℃靜置2 h， 3 500 r·min-1離心15 min。檢測血清中SOD和MDA，小鼠解剖分離胸腺，稱重。

1.2.5 電子鼻檢測方法

樣品收集：將小鼠置于潔凈鼠籠，以牛乳清蛋白干預(yù)7周，每隔7 d收集糞便每籠收集40粒糞便，置于5 mL無菌離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩嶒炃?，將樣品恢?fù)至室溫，進(jìn)行電子鼻檢測。

電子鼻檢測：電子鼻響應(yīng)信號受樣品量、頂空生成時間、頂空生成體積及載氣流速等因素影響，故采用單因素實驗優(yōu)化實驗條件(表3)。每次檢測，取糞便樣品于燒杯中，保鮮膜封口靜置一定時間，使其生成一定的頂空氣體，后進(jìn)行電子鼻檢測，每組樣品 40 個平行，設(shè)定電子鼻信號采集時間60 s，清洗時間80 s，本研究均選取傳感器穩(wěn)態(tài)第59秒響應(yīng)值進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

表3 電子鼻單因素試驗水平表

采用典則判別分析(canonical discriminant analysis，CDA)和方差(one-way ANOVA)分析，以確定較佳的電子鼻檢測參數(shù)。采用CDA和主成分分析(principal component analysis，PCA)綜合判別不同灌胃給藥物和不同灌胃給藥周數(shù)小鼠糞便的差異。采用典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis，CCA)，綜合判別小鼠糞便電子鼻氣味信息與其生理指標(biāo)的相關(guān)性。采用多元線性回歸模型(multiple linear regression，MLR)建立電子鼻信號與小鼠的體重變化和衰老周期的關(guān)聯(lián)關(guān)系。數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS 16軟件和SAS V8軟件分析，由Origin8 Pro 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠生理指標(biāo)檢測結(jié)果

牛乳清蛋白對小鼠血清中SOD、MDA和臟器指數(shù)、體重變化率的影響，結(jié)果見表4。NS-N組、VC組、CWP-L組、CWP-M組和CWP-H組與NS組相比，血清中的SOD活性均升高，MDA顯著含量均降低，表明牛乳清蛋白和VC在小鼠血清中一樣具有抗氧化的能力，且抗氧化能力的強(qiáng)弱與小鼠的給藥量存在一定關(guān)系。給藥牛乳清蛋白各試驗組小鼠的胸腺指數(shù)與NS組比較，差異均顯著，與NS-N組比較，差異均不顯著，說明牛乳清蛋白對小鼠胸腺指數(shù)沒有影響，對小鼠的組織器官沒有毒害作用。

表4 小鼠生理指標(biāo)檢測結(jié)果

2.2 電子鼻檢測較佳條件優(yōu)化確定

2.2.1 樣品量對電子鼻響應(yīng)信號的影響

取糞便樣品于頂空生成時間為10 min、頂空生成體積250 mL、300 mL·min-1載氣流速、采樣60 s，清洗80 s，研究樣品量(1、2、3粒)對電子鼻傳感器響應(yīng)信號的影響。方差分析和CDA結(jié)果見表5和圖1-a。方差分析結(jié)果表明：樣品量對傳感器S4、S7、S8和S9的影響統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P<0.01)，傳感器S2和S3的影響統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)，其他傳感器影響不顯著。圖1-a中，CDA分析結(jié)果第一主成分占72.51%，第二主成分占27.49%，總貢獻(xiàn)率為100%，能反映全部原始數(shù)據(jù)信息。樣品量2粒和樣品量3粒組數(shù)據(jù)點有部分重疊，樣品量1粒的數(shù)據(jù)能與樣品量2粒和樣品量3粒組的數(shù)據(jù)有很好地區(qū)分，且樣品量1粒組的數(shù)據(jù)點較為集中，所以選擇1粒老鼠糞便作為較佳的樣品量。

2.2.2 頂空生成時間對電子鼻響應(yīng)信號的影響

取糞便樣品1粒、頂空生成體積250 mL、載氣流速300 mL·min-1、采樣時間60 s，清洗80 s，研究頂空生成時間(5、10、15 min)對電子鼻傳感器響應(yīng)信號的影響。方差分析和CDA結(jié)果見表5和圖1-b。方差分析結(jié)果表明：頂空生成時間對傳感器S1、S3、S6、S7、S8、S9和S10影響極顯著(P<0.01)；對傳感器S2和S4的影響顯著(P<0.05)，對傳感器S5影響不顯著。CDA結(jié)果中第一成分占94.32%，第二主成分占5.68%，總貢獻(xiàn)率為100%，能反映全部的原始數(shù)據(jù)信息。圖1-b中，5 min和15 min彼此有較多重疊；10 min數(shù)據(jù)組能與5 min和15 min組的數(shù)據(jù)有很好的區(qū)分；且10 min組的數(shù)據(jù)點聚集性較好，故選擇10 min作為較佳的頂空生成時間。

表5 單因素方差分析結(jié)果

圖1 電子鼻單因素實驗的CDA分析結(jié)果Fig.1 CDA analysis results of E-nose single factor experiment

2.2.3 頂空生成體積對電子鼻響應(yīng)信號的影響

取糞便樣品1粒、頂空生成時間10 min、載氣流速300 mL·min-1、采樣時間60 s、清洗80 s，研究頂空生成體積(150、250、500 mL)對電子鼻傳感器響應(yīng)信號的影響。方差分析和CDA結(jié)果見表5和圖1-c。由方差分析結(jié)果表明：頂空生成體積對傳感器S2影響不顯著(P>0.05)，對傳感器S5影響顯著(P<0.05)，對其余8個傳感器的影響極顯著(P<0.01)。CDA結(jié)果中第一主成分占94.10%，第二主成分占5.90%，總貢獻(xiàn)率為100%，能代表全部原始數(shù)據(jù)信息。圖1-c中，不同頂空生成體積的數(shù)據(jù)點中，雖150 mL和250 mL彼此有重疊；但從數(shù)據(jù)點的聚集性來看，150 mL的數(shù)據(jù)點相較于另兩組數(shù)據(jù)點更為集中，所以選擇150 mL作為較佳的頂空生成體積。

2.2.4 載氣流速對電子鼻響應(yīng)信號的影響

取糞便樣品1粒、頂空生成時間10 min、頂空生成體積250 mL、采樣時間60 s，清洗80 s，研究載氣流速(200、300、400 mL·min-1)對電子鼻傳感器響應(yīng)信號的影響。方差分析和CDA結(jié)果見表5和圖1-d。方差分析結(jié)果表明：除載氣流速對傳感器S5影響不顯著(P>0.05)外，對其余9個傳感器的影響極顯著(P<0.01)。CDA結(jié)果中第一主成分占72.77%，第二主成分占27.23%，總貢獻(xiàn)率為100%，能反映全部的原始數(shù)據(jù)信息。圖1-d中，不同載氣流速數(shù)據(jù)點較為分散且相互之間都有交疊；但從數(shù)據(jù)點的聚集性來看，200 mL·min-1數(shù)據(jù)組優(yōu)于另外兩組，故選擇200 mL·min-1作為較佳的載氣流速。

2.3 小鼠糞便氣味信息傳感器特征響應(yīng)曲線

在2.2節(jié)優(yōu)化的檢測條件下，每隔1周檢測采集的表2中不同灌胃給藥小鼠的糞便樣品氣味信息。圖2給出了NS-N、VC、NS、CWP-L、CWP-M、CWP-H組小鼠糞便樣品第7 周的電子鼻特征響應(yīng)曲線。如圖2所示，橫坐標(biāo)為檢測時間，縱坐標(biāo)為10根傳感器響應(yīng)信號。檢測初期，傳感器對小鼠糞便樣品中的揮發(fā)物迅速響應(yīng)，但基本都在40 s之后逐漸趨于平衡；而不同灌胃給藥物的小鼠糞便樣品對信號強(qiáng)度的響應(yīng)信號有所不同：對NS-N組和VC組小鼠糞便樣品對傳感器S7的響應(yīng)最為強(qiáng)烈，其次為S6；而NS、CWP-L、CWP-M和CWP-H組的小鼠糞便樣品對S6傳感器的響應(yīng)最為強(qiáng)烈，其次為S7。這為基于電子鼻信息檢測區(qū)分不同灌胃給藥物的小鼠糞便及其7周變化的判別區(qū)分奠定了基礎(chǔ)。

圖2 不同灌胃給藥組小鼠糞便樣品的電子鼻特征響應(yīng)信號(第7周)Fig.2 Characteristic sensor response signals of fecal samples of mice in different groups (7th week)

2.4 定性識別不同灌胃給藥小鼠糞便樣品

對NS-N組、VC組、NS組、CWP-L組、CWP-M組和CWP-H組小鼠糞便樣品傳感器第59 秒響應(yīng)，采用SAS軟件進(jìn)行PCA和CDA判別，結(jié)果見圖3。從圖3-a可知，第一主成分61.48%、第二主成分23.85%和第三主成分9.89%，共解釋了原始變量95.22%的信息；PCA基本可將6種干預(yù)小鼠糞便有效區(qū)分，且不同干預(yù)組數(shù)據(jù)點呈現(xiàn)規(guī)律性分布，即右側(cè)的牛乳清蛋白組(CWP-L組、CWP-M組和CWP-H組)和左側(cè)對照組(NS-N組、VC組和NS組)。圖3-b CDA結(jié)果，第一主成分為65.62%，第二主成分為17.35%，共解釋了原始變量82.97%的信息；除部分?jǐn)?shù)據(jù)點重疊外，CDA基本可將對6種干預(yù)小鼠糞便樣品彼此區(qū)分，且數(shù)據(jù)點組內(nèi)集聚，結(jié)合PCA和CDA，利用糞便的電子鼻氣味可以實現(xiàn)鑒別不同干預(yù)小鼠糞便的氣味，為基于氣味信息的食品體內(nèi)功能性評價提供基礎(chǔ)。

2.5 定性識別不同灌胃給藥周期小鼠糞便樣品

對CWP-L組、CWP-M組和CWP-H組灌胃給藥7周小鼠糞便樣品傳感器第59秒響應(yīng)，采用SAS軟件進(jìn)行CDA判別，結(jié)果見圖4。從圖4-a可知，CWP-L組CDA結(jié)果第一主成分61.74%、第二主成分20.78%，共解釋了原始變量82.52%的信息；CWP-M組CDA結(jié)果第一主成分68.10%、第二主成分18.87%，共解釋了原始變量86.97%的信息；CWP-H組CDA結(jié)果第一主成分83.82%、第二主成分13.36%，共解釋了原始變量97.18%的信息；除部分?jǐn)?shù)據(jù)點重疊外，CDA基本可將灌胃給藥低(a)、中(b)、高(c)濃度牛乳清蛋白的小鼠糞便樣品7周小鼠糞便有效區(qū)分，且不同周數(shù)組數(shù)據(jù)點呈現(xiàn)規(guī)律性分布，即從右向左依次遞增灌胃給藥周數(shù)(0周組、1周組、3周組、5周組和7周組)，數(shù)據(jù)點組內(nèi)集聚。通過CDA，可利用糞便的電子鼻氣味實現(xiàn)鑒別不同干預(yù)周數(shù)小鼠糞便的氣味。

圖3 不同灌胃給藥小鼠糞便樣品的電子鼻PCA(a)和CDA(b)判別結(jié)果(第7周)Fig.3 The results of PCA(a) and CDA(b) discrimination of mice feces treated by different intragastric administration(7th week)

圖4 灌胃給藥低(a)、中(b)、高(c)濃度牛乳清蛋白的小鼠糞便樣品7周氣味信息變化的電子鼻CDA判別結(jié)果Fig.4 The results of electronic nose CDA discriminating the change of odor information in the fecal samples of mice with bovine whey protein at low (a)， medium (b) and high (c) concentrations administered by gavage for 7 weeks

2.6 與其生理指標(biāo)相關(guān)關(guān)系

結(jié)合小鼠第7周的糞便氣味信息與生理指標(biāo)，通過典型相關(guān)分析，如圖5所示，熱圖中表明生理指標(biāo)SOD與傳感器S1、S2、S3、S6、S7、S8和S10有極顯著(P<0.01)相關(guān)性，與S4、S5有顯著(P<0.05)相關(guān)性；MDA與傳感器S4、S7和S9有極顯著(P<0.01)相關(guān)性，與S2、S6有顯著(P<0.05)相關(guān)性；體重增長率與S1、S2、S4、S7、S8、S10有極顯著(P<0.01)相關(guān)性，與S3有顯著(P<0.05)相關(guān)性；胸腺指數(shù)與傳感器S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S10有極顯著(P<0.01)相關(guān)性；表明小鼠的糞便電子鼻氣味信息與其生理指標(biāo)兩者有著極好的相關(guān)性，為通過基于電子鼻信息檢測不同灌胃給藥物的小鼠糞便氣味信息構(gòu)建預(yù)測其體重變化率模型奠定了基礎(chǔ)。

圖5 小鼠糞便電子鼻氣味信息與其生理指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系(第7周)Fig.5 Correlation between the odor information of mouse fecal electronic nose and its physiological indicators (7th week)

2.7 定量預(yù)測小鼠的周期體重變化

為跟蹤不同干預(yù)階段小鼠體內(nèi)變化，采用多元性回歸分析(MRL)建立了老小鼠周期體重的預(yù)測模型(圖6)。

對小鼠體重，建立的MRL預(yù)測模型方程為：

y1=12.002S1-1.119S2-71.716S3-5.095S4+3.075S5+0.303S6+0.239S7-1.252S8-10123S9-8.621S10+110.732。

(1)

式(1)中：y1為小鼠體重；S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10為各傳感器的特征值。

圖6 MRL定量預(yù)測小鼠體重變化模型Fig.6 Predictive model built by MLR for body weight

3 結(jié)論與討論

營養(yǎng)補(bǔ)充可影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，乳清蛋白可提高菌群多樣性，還可提高或維持腸道益生菌的相對豐度，同時降低了腸道有害菌群的豐度[7]。腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物組成和含量的差異[22-23]，外部表現(xiàn)為氣味的變化。通過電子鼻監(jiān)控糞便氣味變化，反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而反應(yīng)營養(yǎng)補(bǔ)充或膳食干預(yù)的作用僅有初步嘗試研究。

因糞便中揮發(fā)性代謝物的電子鼻響應(yīng)信號受外部條件的影響，如性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、抽煙史、飲食、合并疾病及用藥等生活方式[17]，本研究通過方差分析結(jié)合CDA研究了不同因素對電子鼻傳感器響應(yīng)的影響，優(yōu)化獲得小鼠糞便氣味信息電子鼻檢測的條件為：糞便樣品1粒、頂空生成時間10 min、頂空生成體積150 mL和進(jìn)樣流速200 mL·min-1。對糞便氣味信息，李書藝等[19]在其研究中發(fā)現(xiàn)的荔枝殼原花青素低聚體灌胃SD大鼠糞便的氣味響應(yīng)明顯低于空白組樣品；綜合3個觀測時間點糞便氣味信息，El Manouni el Hassani等[18]發(fā)現(xiàn)母乳(BM)和配方奶粉(FM)2種喂養(yǎng)方式早產(chǎn)兒糞便揮發(fā)性組分氣味差異顯著；本研究發(fā)現(xiàn)，對不同干預(yù)小鼠糞便，其電子鼻氣味信息強(qiáng)度均有差異。結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法綜合分析電子鼻氣味信息時發(fā)現(xiàn)，電子鼻信息結(jié)合PCA和CDA，均可將對應(yīng)小鼠糞便樣品判別區(qū)分，基于氣味評價不同營養(yǎng)干預(yù)具有可信性，這與葛茵等[21]對腸道發(fā)酵液氣味的定性區(qū)分效果相似?；谀c道發(fā)酵液樣品的氣味指紋，葛茵等[21]構(gòu)建了菌門數(shù)據(jù)的預(yù)測模型；本研究采用多元線性回歸模型建立了小鼠體重預(yù)測模型，其決定系數(shù)(R2)值為0.122 7，效果尚可；但通過典型相關(guān)分析結(jié)果表明，糞便電子鼻氣味信息與其生理指標(biāo)兩者有著極好的相關(guān)性，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，為今后基于氣味信息評價體內(nèi)指標(biāo)提供理論支撐，基于糞便中揮發(fā)性代謝物的傳感器響應(yīng)無創(chuàng)評價乳清蛋白體內(nèi)活性具有可行性。