楊昕霞， 張 斌

(湖南科技學院 a. 后勤處；b. 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199)

LAZ1(Lazarus 1)是真核生物中具有DUF300保守結構域的跨膜蛋白，在脊椎動物中作為有機溶質轉運蛋白發(fā)揮功能[1]。但是，在植物中關于LAZ1家族基因功能的報道非常少。在擬南芥中，含DUF300域的蛋白質家族包含7個成員，其中僅LAZ1(AT4G38360，AtLAZ1-6)及其同源基因LAZ1H1(AT1G77220，AtLAZ1-3)的功能有明確報道。Malinovsky等[2]發(fā)現(xiàn)，LAZ1有助于擬南芥突變體acd11中細胞程序性死亡和由病原體觸發(fā)的超敏反應的發(fā)生。LAZ1和LAZ1H1與一類保守的OST-α跨膜蛋白家族具有較高的同源性，而OST-α跨膜蛋白與動物中類固醇化合物的膜運輸有關[3-4]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，LAZ1和LAZ1H1基因功能的缺失會導致液泡形態(tài)缺陷、生長受到抑制和油菜素內酯信號的組成性激活。擬南芥laz1突變體的形態(tài)略小，但與野生型對照沒有明顯差異；而laz1laz1h1雙突變體則表現(xiàn)出嚴重的生長抑制作用，說明擬南芥中LAZ1和LAZ1H1基因功能冗余或部分重疊，且對植物生長來說是必要的[5]。Liu等[1]在玉米基因組中鑒定出9個LAZ1家族成員，并對其進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，證明玉米LAZ1家族基因的相對表達水平在不同組織和發(fā)育階段表現(xiàn)出多樣性，并且能夠響應脫落酸(ABA)、干旱和NaCl處理。同時，玉米ZmLAZ蛋白(NP_001183680.1)能夠與ZmSnRK2家族的8個成員相互作用[6]，而這些ZmSnRK2成員被確定為ABA信號傳導途徑的核心組成部分，并在非生物脅迫方面起著至關重要的作用[7-8]。但在本研究檢索范圍內，尚未見在植物中進一步驗證LAZ1家族基因與非生物脅迫直接關系的報道。

植物在生長過程中經(jīng)常會受到一些不利環(huán)境因素的影響，如干旱、鹽、極端溫度等。隨著全球氣候變暖，環(huán)境脅迫出現(xiàn)得更加頻繁，且持續(xù)時間更長，這將對植物的生長、發(fā)育和農作物產量產生重大不利影響[9]。大豆是我國重要的糧油作物，同時也為動物飼料制造提供原料。鹽害會影響大豆的正常生長，進而導致減產。目前，關于大豆響應鹽脅迫的分子機制已有較多報道，涉及ABA信號途徑、SOS信號途徑、轉錄因子調控等[10]。但是，關于LAZ1家族基因在大豆鹽脅迫中的功能研究尚未見報道。本研究從大豆基因組中鑒定出17個LAZ1家族基因成員，并對其染色體定位、基因和蛋白結構、啟動子區(qū)的順式作用元件、在不同組織的表達模式，以及鹽脅迫誘導下的表達情況進行了分析，利用轉基因擬南芥材料對GmLAZ1-9基因在耐鹽性方面的功能進行研究，以期為進一步探究其他LAZ1家族基因的功能與分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗使用的植物材料包括栽培大豆(天隆1號)和哥倫比亞野生型擬南芥(Col-0)，雙元表達載體為pFGC5941，大腸埃希菌感受態(tài)為DH5α，根癌農桿菌感受態(tài)為GV3101。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆LAZ1家族成員鑒定及其理化性質預測

根據(jù)已報道的擬南芥[5]和玉米LAZ1[1]家族成員的氨基酸序列，在大豆數(shù)據(jù)庫(http://soykb.org/)進行BLAST比對，下載所有比對出的氨基酸序列，利用SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)檢查下載的氨基酸序列是否含有保守的DUF300結構域(PF03619)。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(https://web.expasy.org/protparam/)對大豆LAZ1家族成員的理化性質，包括蛋白相對分子質量、總平均親水性(GRAVY)、理論等電點(pI)和不穩(wěn)定系數(shù)進行預測[11]。

1.2.2 染色體定位分析與系統(tǒng)進化樹構建

大豆LAZ1基因家族成員在染色體上的位置信息從Phytozome v12.0數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info？alias=Org_Gmax)下載整理，大豆染色體總長度從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Glycine+max)下載。基于LAZ1家族基因的染色體位置信息及其所在染色體的總長度，利用Map Chart 2.2軟件繪制染色體定位圖。利用Clustal X和MAGA 7軟件構建大豆、擬南芥、水稻和玉米LAZ1家族的系統(tǒng)進化樹，參數(shù)設置如下：泊松模型，NJ(neighbor-joining)法，校驗參數(shù)Bootstrap為1 000。

1.2.3 大豆LAZ1家族成員的基因和蛋白結構

在Phytozome數(shù)據(jù)庫下載LAZ1家族成員的基因、蛋白質編碼區(qū)(CDS)和蛋白序列。利用LAZ1的基因和CDS序列在GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結構圖；利用MEME數(shù)據(jù)庫(http://meme-suite.org/tools/meme)分析大豆LAZ1家族蛋白的保守基序(motif)，參數(shù)設置如下：保守motif最小長度為6，最大長度為50，數(shù)量設置為10。

1.2.4 啟動子順式作用元件預測和大豆LAZ1家族基因的表達模式分析

下載大豆LAZ1家族成員ATG上游2 000 bp的序列作為啟動子區(qū)，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析啟動子區(qū)的順式作用元件，并統(tǒng)計能夠響應非生物脅迫的元件類型與數(shù)量。LAZ1家族基因在不同組織(根、根毛、莖、莖尖分生組織、葉、花、果莢殼、種子、根瘤)中的表達數(shù)據(jù)從Phytozome數(shù)據(jù)庫中進行整理，所有的FPKM值經(jīng)公式ln(X+1)計算后用于表示基因的相對表達水平[12]，并利用Hem v1.0軟件繪制基因表達熱圖。

利用半定量PCR檢測大豆LAZ1基因響應鹽脅迫的表達模式。使用150 mmol·L-1NaCl處理生長1周的大豆幼苗，于0、3、6、12 h時取樣，用于RNA提取和基因表達檢測，Actin基因(LOC100781831)作為內參基因。

1.2.5 過表達載體構建與擬南芥轉化

使用高保真聚合酶克隆GmLAZ1-9基因的全長CDS序列，插入pFGC5941載體特定位點，獲得過表達載體35S∶∶GmLAZ1-9。重組質粒經(jīng)測序驗證正確后導入根癌農桿菌GV3101，使用浸花法轉化野生型擬南芥(Col-0)，經(jīng)草銨膦篩選和PCR鑒定獲得純合的T3代轉基因擬南芥材料，將其命名為OEGmLAZ1-9(T3)。

1.2.6 轉基因擬南芥耐鹽性分析

野生型擬南芥(WT)和轉基因擬南芥(OEGmLAZ1-9)種子經(jīng)75%乙醇消毒后，均勻播種于1/2MS培養(yǎng)基和含有200 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，于4 ℃暗置3 d，然后置于生長室培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計萌發(fā)率。生長室條件：恒溫25 ℃，長日照(晝16 h/夜8 h)，相對濕度50%～70%。擬南芥材料在營養(yǎng)土中正常生長4周后，用150 mmol·L-1NaCl水溶液處理7 d，拍照觀察表型，利用Jia等[13]和Manzi等[14]報道的方法測定葉片相對含水量、丙二醛(MDA)含量與脯氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 大豆LAZ1家族基因的鑒定與理化性質分析

本研究在大豆基因組中共鑒定到17個LAZ1家族成員，根據(jù)其在染色體上的先后順序，依次命名為GmLAZ1-1～GmLAZ1-17。對LAZ1家族成員的理化性質進行分析(表1)，結果顯示，基因長度在2 547～9 833 bp，氨基酸長度在287～492 aa，其中，GmLAZ1-9的基因長度最大(9 833 bp)，但卻具有最小的氨基酸長度(287 aa)；蛋白的相對分子質量在32.65 ku(GmLAZ1-3)～55.25 ku(GmLAZ1-5)；等電點(pI)在4.35(GmLAZ1-7)～9.56(GmLAZ1-15)；不穩(wěn)定系數(shù)在26.55～49.15，其中穩(wěn)定蛋白(即不穩(wěn)定系數(shù)小于40的)有4個，分別為GmLAZ1-6、GmLAZ1-9、GmLAZ1-14和GmLAZ1-15。

表1 大豆LAZ1家族基因成員的理化性質

2.2 大豆LAZ1家族成員的染色體定位、系統(tǒng)進化樹、蛋白和基因結構分析

利用Map Chart 2.2軟件繪制大豆LAZ1家族基因的染色體定位圖，發(fā)現(xiàn)17個GmLAZ1家族基因分布在12條染色體上，其中6號染色體(chr6)上有3個成員，4、13和15號染色體上各分布有2個成員，其余8條染色體上均只有1個基因(圖1-A)。為了研究栽培大豆LAZ1家族基因和其他物種的關系，本研究構建了大豆、玉米、水稻和擬南芥LAZ1家族成員的系統(tǒng)進化樹，可將LAZ1家族分為3個亞家族(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，其中亞家族I包括8個大豆LAZ1家族成員，亞家族Ⅱ包括4個成員，亞家族Ⅲ包含5個成員(圖1-B)。對大豆LAZ1家族成員的基因結構和保守motif進行分析發(fā)現(xiàn)，除GmLAZ1-3和GmLAZ1-15外，分布在同一亞家族的成員在基因結構和保守motif類型與分布方面基本一致(圖1-C)。

A，大豆LAZ1家族基因的染色體定位；B，大豆和其他物種(擬南芥、水稻和玉米)LAZ1家族成員的系統(tǒng)進化樹；C，大豆LAZ1家族蛋白和基因結構，及氨基酸保守基序分析。A， Chromosomal location of soybean LAZ1 family genes; B， Phylogenetic tree of members of the LAZ1 family of soybeans and other species (Arabidopsis， rice， and maize); C， Analysis of gene structure and amino acid conservative motifs of soybean LAZ1 family members.圖1 大豆LAZ1家族成員的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of soybean LAZ1 family members

2.3 大豆LAZ1家族基因的組織表達和鹽誘導表達模式

基于大豆數(shù)據(jù)庫中LAZ1家族成員的基因表達FPKM值(數(shù)據(jù)庫中無GmLAZ1-14的表達數(shù)據(jù))，發(fā)現(xiàn)GmLAZ1家族基因在不同組織中的表達存在較大差異，GmLAZ1-9在9個組織(根、根毛、莖、莖尖分生組織、葉、花、果莢殼、種子、根瘤)中的表達水平均最高，GmLAZ1-8、GmLAZ1-11、GmLAZ1-13和GmLAZ1-17也表現(xiàn)出總體較高的表達水平(圖2)。利用PlantCARE在線工具進一步分析GmLAZ1家族基因啟動子區(qū)的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)存在很多與非生物脅迫響應相關的元件，如ABRE、ARE、LTR、G-box等(圖3-A)。因此，利用半定量PCR檢測了鹽處理條件下大豆GmLAZ1家族基因的表達情況(圖3-B)。GmLAZ1-5、GmLAZ1-9、GmLAZ1-11和GmLAZ1-13在鹽處理后表達水平明顯上升，其中GmLAZ1-9和GmLAZ1-13的表達量在鹽處理6 h和12 h時明顯高于0 h；GmLAZ1-5在鹽處理3 h和6 h時表達上調，GmLAZ1-11在鹽處理3 h時表達上調。

2.4 GmLAZ1-9基因過表達增強擬南芥耐鹽性

本研究構建了GmLAZ1-9基因的過表達載體，利用農桿菌介導的浸花轉化法獲得了大豆GmLAZ1-9基因過表達的轉基因擬南芥(T3代純合子材料)。萌發(fā)實驗(圖4)表明，在正常1/2MS培養(yǎng)基上，WT和OEGmLAZ1-9擬南芥均可正常萌發(fā)，子葉展開，萌發(fā)率分別為93.4%和95.7%；而在含200 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，OEGmLAZ1-9的萌發(fā)率(26.3%)顯著(P<0.05)高于WT(7.9%)。進一步對生長4周的擬南芥植株進行鹽處理，發(fā)現(xiàn)WT和OEGmLAZ1-9的生長均受到抑制，葉片萎蔫，但OEGmLAZ1-9的長勢優(yōu)于WT。

右側色彩刻度標尺代表基因表達量的高低，從灰到紅色表示表達量數(shù)值從低到高。The color scale on the right represents the level of gene expression. From gray to red， the value of expression increases from low to high.圖2 大豆LAZ1家族基因在不同組織中的表達模式Fig.2 Expression patterns of soybean LAZ1 genes in different tissues

A，大豆LAZ1家族基因啟動子區(qū)與非生物脅迫響應相關的順式作用元件；B，利用半定量PCR檢測LAZ1家族基因在150 mmol·L-1 NaCl處理0、3、6、12 h時的表達情況。A， Abiotic stress-related cis-acting elements in the promoters of soybean LAZ1 genes; B， Expression of LAZ1 genes at 0， 3， 6， 12 h after treatment with 150 mmol·L-1 NaCl based on semi-quantitative PCR test.圖3 大豆LAZ1家族基因啟動子區(qū)的順式作用元件與LAZ1家族基因在鹽處理條件下的表達模式Fig.3 Cis-acting element in soybean LAZ1 gene promoters and expression patterns of LAZ1 genes under salt treatment

葉片相對含水量和MDA含量能夠反映植物在脅迫條件下的受傷害程度：鹽脅迫下葉片相對含水量越低，說明植物受傷害程度越大；MDA含量越高，表示植物受傷害越嚴重。滲透調節(jié)物質脯氨酸的積累有利于增強植物耐鹽、耐旱的能力[13-14]。本實驗測定了正常和鹽處理條件下擬南芥葉片中的相對含水量，及脯氨酸和MDA含量。結果顯示，鹽處理條件下OEGmLAZ1-9擬南芥的葉片相對含水量和脯氨酸含量顯著(P<0.05)高于WT，而MDA含量則顯著(P<0.05)低于WT，說明過表達GmLAZ1-9基因的擬南芥在鹽脅迫條件下受傷害程度較輕，其耐鹽性更強。

野生型擬南芥WT和轉基因材料OEGmLAZ1-9在1/2MS培養(yǎng)基和1/2MS+200 mmol·L-1 NaCl培養(yǎng)基上萌發(fā)7 d的表型(A)和萌發(fā)率統(tǒng)計(B)；生長4周的擬南芥(WT和OEGmLAZ1-9)在正常生長和150 mmol·L-1 NaCl溶液處理7 d的表型(C)、葉片相對含水量(D)、MDA含量(E)、脯氨酸含量(F)。D～F圖中柱上標“*”的表示不同材料間差異顯著(P<0.05)。Phenotype (A) and germination rate (B) of the wild-type Arabidopsis WT and the transgenic material OEGmLAZ1-9 seeds for 7 days on 1/2MS medium and 1/2MS+200 mmol·L-1 NaCl medium; Phenotype (C)， relative water content (D)， and content of MDA (E) and proline (F) of 4-week-old Arabidopsis(WT and OEGmLAZ1-9) grown in normal condition and 150 mmol·L-1 NaCl solution for 7 days. Bars in D-F marked with “*” indicated significant difference between test materials at P<0.05 under the same condition.圖4 過表達大豆GmLAZ1-9基因增強轉基因擬南芥的耐鹽性Fig.4 Overexpression of soybean GmLAZ1-9 gene enhanced salt tolerance of transgenic Arabidopsis

3 結論與討論

本研究從大豆基因組中鑒定出17個LAZ1家族基因，已報道的擬南芥和玉米中分別含有7個[5]和9個LAZ1家族成員[1]，而目前尚未見到關于其他植物LAZ1家族成員的全基因組學鑒定或單個基因功能的研究報道。通常認為，在系統(tǒng)進化樹上聚集在同一亞家族的基因可能具有類似的功能[12]，大豆、玉米、水稻和擬南芥LAZ1基因家族成員在進化樹上可分為3個亞家族(I、II和III)，已報道功能的擬南芥LAZ1(AT4G38360，AtLAZ1-6)及其同源基因LAZ1H1(AT1G77220，AtLAZ1-3)均屬于I亞族，可推測此亞家族中的大豆GmLAZ1-2、GmLAZ1-3、GmLAZ1-4、GmLAZ1-5、GmLAZ1-7、GmLAZ1-10、GmLAZ1-12、GmLAZ1-14基因可能與擬南芥LAZ1和LAZ1H1具有類似的功能，在植物生長調控和油菜素內酯信號激活方面發(fā)揮功能。同一亞家族內各成員的基因和蛋白結構類似，推測GmLAZ1-3和GmLAZ1-15蛋白可能在進化過程中丟失部分功能域。這種情況在玉米中也有所體現(xiàn)，如ZmLAZ1-2僅含有1個保守motif[1]。植物基因的組織表達模式與其發(fā)揮的功能有緊密的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆LAZ1家族基因在不同組織的表達水平存在較大差異，其中GmLAZ1-9在所有組織中的表達水平均最高，GmLAZ1-8、GmLAZ1-11、GmLAZ1-13和GmLAZ1-17也表現(xiàn)出總體較高的表達水平，說明這些基因可能對大豆的生長發(fā)育非常重要?；騿幼由系捻樖阶饔迷谡{控植物生長發(fā)育和與環(huán)境互作方面起著非常重要的作用[15]，在GmLAZ1家族基因啟動子區(qū)存在很多與非生物脅迫響應相關的元件，如ABRE、ARE、LTR、G-box、MYB、W-box[15-18]，并且GmLAZ1-5、GmLAZ1-9、GmLAZ1-11和GmLAZ1-13的表達水平受鹽脅迫誘導上調，暗示了大豆LAZ1家族成員可能在鹽脅迫響應過程中發(fā)揮著特定功能。Liu等[1]對玉米LAZ1家族基因的表達鑒定也發(fā)現(xiàn)，ZmLAZ1家族基因能夠響應脫落酸、聚乙二醇(PEG)模擬干旱和NaCl脅迫誘導，表達水平上調或下調。

基于基因的組織和鹽誘導表達分析結果，本研究對GmLAZ1-9的功能做了研究，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下過表達GmLAZ1-9基因的擬南芥萌發(fā)率顯著高于野生型WT。鹽處理條件下，OEGmLAZ1-9擬南芥材料在營養(yǎng)土中的長勢優(yōu)于WT，葉片的相對含水量和脯氨酸含量顯著高于WT，而MDA含量則低于WT，說明鹽脅迫下OEGmLAZ1-9受傷害程度較輕，即在擬南芥中過表達GmLAZ1-9基因增強了轉基因擬南芥對鹽害的耐受性。但是，大豆GmLAZ1-9基因增強轉基因擬南芥耐鹽性的詳細分子機制還需進一步探究。此外，其他大豆LAZ1基因是否也參與植物鹽脅迫或其他非生物脅迫響應也是應繼續(xù)關注的研究方向。