王鋒?丁艷?張煥基

【摘要】循環(huán)游離DNA（cfDNA）是循環(huán)體液中游離狀態(tài)的DNA，其在體內(nèi)的釋放被認為與細胞的壞死、凋亡等相關(guān)。近年來cfDNA甲基化檢測作為一種“液體活組織檢查”技術(shù)已成為疾病診療中的研究熱點。心肌梗死后外周血循環(huán)中cfDNA的含量升高，并發(fā)現(xiàn)cfDNA升高與心肌梗死后并發(fā)癥的發(fā)生有相關(guān)性。近年來通過甲基化模式分析尋找到心肌細胞特異性的cfDNA，使cfDNA檢測能夠為心肌梗死提供更多客觀的評估證據(jù)。該文綜述近幾年國內(nèi)外cfDNA甲基化模式分析在心肌梗死中的研究進展。

【關(guān)鍵詞】循環(huán)游離脫氧核糖核酸;甲基化;液體活組織檢查;心源性游離脫氧核糖核酸;

心肌梗死

Research progress on circulating cell-free DNA methylation pattern analysis in myocardial infarction Wang Feng， Ding Yan， Zhang Huanji. Department of Cardiology， the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518033， China

Corresponding author， Zhang Huanji， E-mail： huanji13688808979@ 163. com

【Abstract】Circulating cell-free DNA （cfDNA） is the free DNA existing in circulating blood， and its release is related to cell death and apoptosis， etc. In recent years， cfDNA methylation detection， as a “l(fā)iquid biopsy” technique， has become a hot research topic in the diagnosis and treatment of diseases. The content of cfDNA is increased in the peripheral blood circulation after myocardial infarction， which has been proven to be correlated with the occurrence of complications after myocardial infarction. Through the analysis of cfDNA methylation pattern， cardiomyocyte-specific cfDNA can be identified， providing more objective evaluation evidence for myocardial infarction. In this article， recent research progress on cfDNA methylation pattern analysis in myocardial infarction at home and abroad was reviewed.

【Key words】Circulating cell-free deoxyribonucleic acid;Methylation; Liquid biopsy;

Cardiomyocyte-specific cell-free deoxyribonucleic acid;Myocardial infarction

循環(huán)游離DNA（cfDNA）是指存在于循環(huán)體液中的游離DNA片段，近年來被廣泛應用于腫瘤診療、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、免疫系統(tǒng)疾病診療等領(lǐng)域[1-2]。cfDNA在人體中廣泛存在，除了存在于外周血液中，還可在腦脊液、尿液等循環(huán)體液中被檢測到[3]。cfDNA的來源途徑有多種，除了病理狀態(tài)下（如腫瘤、炎癥、免疫反應）可產(chǎn)生cfDNA，運動、衰老、心理應激等生理狀態(tài)也可導致cfDNA的釋放[4]。當組織器官發(fā)生損傷時，壞死細胞可釋放大量的cfDNA到循環(huán)體液中。心肌梗死伴隨著大量的心肌細胞壞死，可在患者血漿中檢測到cfDNA的水平明顯升高。但血漿中cfDNA含量是否可以作為心肌梗死的觀察指標，這個問題一直存在著爭議，主要原因在于以往的研究并未能明確cfDNA的組織細胞來源。近年來隨著cfDNA甲基化模式分析作為一種新型“液體活組織檢查”技術(shù)在疾病診療的火熱開展，除了可對cfDNA含量進行檢測外，還可對其甲基化模式分析等來獲取更多疾病信息[5-6]。目前通過甲基化模式分析尋找到心肌細胞特異性的cfDNA，并發(fā)現(xiàn)這種心源性cfDNA在心肌梗死的診斷中具有獨特的優(yōu)勢?，F(xiàn)綜述cfDNA及甲基化模式分析在心肌梗死中的研究進展。

一、心肌梗死后外周血中cfDNA含量升高

以往的研究顯示，心肌梗死患者血循環(huán)中cfDNA含量顯著增加，與心肌細胞的凋亡和壞死有關(guān)。Chang等[7]發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血漿中cfDNA含量[（511±389）ng/ml]是健康人群[（36.3±23.8）ng/ml]的10倍。Destouni等[8]通過連續(xù)5 d監(jiān)測心肌梗死患者血漿中cfDNA與健康人群cfDNA的含量，同樣發(fā)現(xiàn)心肌梗死組的cfDNA均保持在10倍的水平。但是心肌梗死后，cfDNA在血中的升高幅度并沒有明確的定論，有研究結(jié)果則顯示心肌梗死患者的cfDNA是健康人的5倍，并且冠狀動脈性心臟病患者血中的cfDNA也要比健康人高[9-11]。

心肌梗死患者血漿中cfDNA的升高可能還與心肌梗死后并發(fā)癥的發(fā)生具有相關(guān)性。有學者根據(jù)有無心肌梗死并發(fā)癥將患者分為2組，可觀察到發(fā)生并發(fā)癥的患者血漿cfDNA最大中位值水平是無并發(fā)癥事件組的3.5倍[8]。另一項研究結(jié)果顯示伴發(fā)心力衰竭或再發(fā)梗死患者血漿中cfDNA比對照組升高2倍，而伴發(fā)心源性猝死的患者cfDNA則升高3倍[12]。而cfDNA水平越高的患者，發(fā)生出院后6個月內(nèi)再入院治療的概率會越高。但有學者指出，這些研究在證明cfDNA與心肌梗死并發(fā)癥的關(guān)系時，并沒有考慮到其他心血管相關(guān)的危險因素（肥胖、高血壓等）[13]。Vora等[14]發(fā)現(xiàn)，BMI水平每增加一個單位（kg/m2），cfDNA總量提高1.7%，說明肥胖等危險因素也會影響心肌梗死后患者血中cfDNA水平。雖然心肌梗死后患者血中的cfDNA水平增加，但是這些cfDNA的增加是非特異性的，cfDNA在血循環(huán)中的釋放受多種因素影響。

二、甲基化模式分析尋找心肌細胞特異性的cfDNA

目前認為cfDNA的序列與細胞基因組DNA的序列相同，但相同序列的cfDNA片段可能源自受損傷組織的實質(zhì)細胞，也可能來自于死亡的炎癥細胞，這使得我們無法通過識別血中升高的cfDNA序列來判斷其來源[3]。DNA甲基化是一種高度穩(wěn)定的表觀遺傳修飾方式，不同的細胞類型具有特定的DNA甲基化模式[15]。當壞死或凋亡的細胞釋放cfDNA到血循環(huán)時，可認為這些cfDNA甲基化模式與其來源組織細胞的甲基化模式高度一致，而其中某些甲基化模式的基因具有較高的組織細胞特異性[16]。因此，可通過分析cfDNA的甲基化模式來確定cfDNA的細胞組織來源。例如，胰島素基因（INS）啟動子區(qū)域在80%的胰腺B細胞中是非甲基化狀態(tài)的，而在其他組織中是呈甲基化狀態(tài)，因此可認為血中非甲基化的INS基因?qū)細胞具有高度特異性[17]。

為了尋找心肌細胞特異性的cfDNA，Zemmour等[18]通過分析cfDNA的甲基化模式來尋找心肌細胞特異性的cfDNA。研究人員在公開的甲基化數(shù)據(jù)庫中將人類心臟中的甲基化小體與其他23種組織的甲基化小體進行了比較，鑒定出了幾個存在差異的甲基化位點，并選擇了一組與FAM101A位點相鄰的胞嘧啶簇做分析[19]。在經(jīng)過重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，通過PCR法擴增了該位點，測定該簇中6個胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌細胞中FAM101A附近位點89%是非甲基化的，而在其他非心肌組織中該位點的非甲基化率< 0.2%。骨骼肌和結(jié)腸平滑肌這2種肌細胞組織中也僅有0.1% ～ 0.2%的FAM101A位點是非甲基化的，證明非甲基化的FAM101A位點具有心肌組織特異性。但是在血液循環(huán)中，大部分的DNA片段是白細胞來源的，而白細胞DNA中FAM101A位點附近非甲基化率< 0.006%，進而排除了白細胞來源的cfDNA干擾[3]。因此認為FAM101A位點的非甲基化DNA片段具有較好的心臟特異性，可選擇該DNA片段作為一種反映心肌細胞損傷的心源性cfDNA來進行研究。

三、心源性cfDNA與傳統(tǒng)心肌梗死標志物的比較

心肌梗死發(fā)生后，目前主要通過心肌肌鈣蛋白（cTn）、CK-MB、肌紅蛋白等傳統(tǒng)的生物標志物來判斷心肌損傷程度，其中以cTn最為敏感。心肌梗死患者會出現(xiàn)血循環(huán)中總cfDNA的升高，但有趣的是，血循環(huán)總cfDNA水平與cTn及CK-MB水平并不存在相關(guān)性，有研究者認為這可能與不同的指標在血中到達峰值的時間不一致有關(guān)[7， 20]。血循環(huán)總cfDNA的升高比CK-MB要早，但是到達峰值的時間卻比CK-MB更晚[7]。而cfDNA到達峰值的時間比cTn要早一些[20]。此外， cfDNA并不只源自于心肌細胞，血循環(huán)總cfDNA含量反映近期機體內(nèi)所有細胞壞死事件，所以會有其他組織來源的cfDNA掩蓋了心臟的特異性信號。

非甲基化FAM101A作為一種心肌細胞來源的cfDNA，同樣能反映心肌梗死后心肌細胞的壞死情況，并且具有較好的心臟特異性。研究者分別在ST段抬高性心肌梗死（STEMI）患者和健康人群的血液樣本中檢測非甲基化FAM101A在血循環(huán)中的含量，發(fā)現(xiàn)這種心源性cfDNA在心肌梗死患者中顯著升高。然后研究者繪制了受試者工作特性（ROC）曲線，得出曲線下面積（AUC）為0.94，說明這種心源性cfDNA對心肌梗死具有較好的靈敏度和特異度。與血循環(huán)總cfDNA不同的是，在心肌梗死患者血中這種心源性cfDNA與cTn升高水平是呈正相關(guān)的，在79%的STEMI患者血中可檢測到兩者幾乎同時升高，并且兩者到達峰值的時間幾乎一致[18]。

cfDNA的代謝途徑與cTn并不相同，cTn主要是通過腎臟來代謝，所以腎功能不全時會使 cTn 的代謝出現(xiàn)異常，此時會影響其對心肌損傷的診斷價值[21]。cfDNA主要是通過肝臟代謝，且在體內(nèi)的代謝速率比cTn快[3]。當冠狀動脈血運成功重建后，心臟再灌注會引起心臟標記物的突然增高。但由于cTn的清除速率慢，在術(shù)后48 h仍可處于較高水平，因此cTn升高對48 h內(nèi)的再發(fā)心肌梗死難以判斷[22]。通過監(jiān)測心肌梗死患者不同時間點血循環(huán)中心源性cfDNA的代謝情況，也可發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后患者血中心源性cfDNA的水平要比術(shù)前高，但在術(shù)后1 ～ 2 d內(nèi)能更快的回到基線水平，清除速率比cTn快。這種在血中快升快降的代謝動力學特性說明心源性cfDNA對再發(fā)心肌梗死的判斷會比cTn更加敏感。

除了在心肌梗死患者血中可出現(xiàn)心源性cfDNA的升高，膿毒血癥和感染性休克的患者血中也可檢測出心源性cfDNA的升高，這可能與心肌細胞壞死相關(guān)[18]。但是心源性cfDNA的升高與患者ALT、AST、血清肌酐水平的關(guān)系并不大，說明心源性cfDNA的升高主要反映機體感染對心肌損傷，而肝腎功能不全對心源性cfDNA的影響不大。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果也顯示心源性cfDNA升高的膿毒血癥患者在90 d內(nèi)死亡風險提高4倍。但是，膿毒血癥患者心源性cfDNA升高水平與cTn升高水平并不相關(guān)，這可能與肝腎功能不全時體內(nèi)cfDNA與cTn清除速率不同有關(guān)。而且，cTn的升高有時并不意味著心肌細胞的壞死，短暫的缺血和應激反應造成的可逆性心肌細胞損傷，甚至是劇烈運動的健康人血中都能檢測到cTn水平的升高[23]。因此，在膿毒血癥和敗血癥等感染性疾病中，心源性cfDNA在血循環(huán)中的升高比cTn更能反映心肌細胞壞死程度，對感染性患者的心肌損傷評估更靈敏，并且對患者預后有一定的預判價值。

四、小結(jié)及展望

通過cfDNA甲基化模式分析尋找的心源性cfDNA，可給心肌梗死后的心肌損傷評估帶來更多客觀的證據(jù)。與傳統(tǒng)的心肌酶譜分析不同的是，心肌細胞釋放的cfDNA是來自于細胞自身攜帶的基因組DNA，因此cfDNA攜帶著豐富且多元化的基因信息。通過甲基化模式分析，能尋找到組織特異性好的cfDNA，彌補了以往無法明確cfDNA組織來源的缺陷。但是目前cfDNA檢測在臨床上的應用還仍然受到限制，一方面是目前的檢測手段如微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的價格成本較高，另外一方面是cfDNA檢測還存在著性別、人群種族、年齡的差異，目前仍難以制定統(tǒng)一的標準去量化。目前除了甲基化模式分析，cfDNA羥甲基化分析逐漸成為新的研究熱點[11]。此外，cfDNA甲基化模式分析除了可分析組織細胞來源外，對組織壞死引起的相關(guān)并發(fā)癥以及壞死事件的預后都有著不錯的評估效果[24-25]。未來是醫(yī)療大數(shù)據(jù)時代，cfDNA攜帶的豐富基因信息是傳統(tǒng)血液標志物所不可比擬的。通過對cfDNA進行多種基因修飾模式分析，以及結(jié)合生物信息學分析手段，未來可為心血管疾病的診斷及預后評估帶來更多客觀證據(jù)。

參 考 文 獻

[1] Dunaeva M， Buddingh BC， Toes RE， Luime JJ， Lubberts E， Pruijn GJ. Decreased serum cell-free DNA levels in rheumatoid arthritis. Auto Immun Highlights，2015，6（1-2）： 23-30.

[2] Bronkhorst AJ， Wentzel JF， Aucamp J， van Dyk E， du Plessis L， Pretorius PJ. Characterization of the cell-free DNA released by cultured cancer cells. Biochim Biophys Acta，2016，1863（1）： 157-165.

[3] Aucamp J， Bronkhorst AJ， Badenhorst CPS， Pretorius PJ. The diverse origins of circulating cell-free DNA in the human body： a critical re-evaluation of the literature. Biol Rev Camb Philos Soc，2018，93（3）：1649-1683.

[4] Hummel EM， Hessas E， Müller S， Beiter T， Fisch M， Eibl A， Wolf OT， Giebel B， Platen P， Kumsta R， Moser DA. Cell-free DNA release under psychosocial and physical stress conditions. Transl Psychiatry，2018，8（1）：236.

[5] Fackler MJ， Lopez Bujanda Z， Umbricht C， Teo WW， Cho S， Zhang Z， Visvanathan K， Jeter S， Argani P， Wang C， Lyman JP， de Brot M， Ingle JN， Boughey J， McGuire K， King TA， Carey LA， Cope L， Wolff AC， Sukumar S. Novel methylated biomarkers and a robust assay to detect circulating tumor DNA in metastatic breast cancer. Cancer Res，2014，74（8）：2160-2170.

[6] Warton K， Samimi G. Methylation of cell-free circulating DNA in the diagnosis of cancer. Front Mol Biosci，2015，2：13.

[7] Chang CP， Chia RH， Wu TL， Tsao KC， Sun CF， Wu JT. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myo-cardial infarction. Clin Chim Acta，2003，327（1-2）：95-101.

[8] Destouni A， Vrettou C， Antonatos D， Chouliaras G， Traeger-Synodinos J， Patsilinakos S， Kitsiou-Tzeli S， Tsigas D， Kanavakis E. Cell-free DNA levels in acute myocardial infarction patients during hospitalization. Acta Cardiol，2009，64（1）：51-57.

[9] Balta S， Demirkol S， Cakar M， Karaman M， Ay SA， Arslan Z. Cell-free circulating DNA as a novel biomarker in patients with the acute coronary syndrome. Cardiology，2013，126（2）：122-123.

[10] Xie J， Yang J， Hu P. Correlations of circulating cell-free DNA with clinical manifestations in acute myocardial infarction. Am J Med Sci，2018，356（2）：121-129.

[11] Dong C， Chen J， Zheng J， Liang Y， Yu T， Liu Y， Gao F， Long J， Chen H， Zhu Q， He Z， Hu S， He C， Lin J， Tang Y， Zhu H. 5-Hydroxymethylcytosine signatures in circulating cell-free DNA as diagnostic and predictive biomarkers for coronary artery disease. Clin Epigenetics，2020，12（1）：17.

[12] Rainer TH， Lam NY， Man CY， Chiu RW， Woo KS， Lo YM. Plasma beta-globin DNA as a prognostic marker in chest pain patients. Clin Chim Acta， 2006，368（1-2）：110-113.

[13] Ilatovskaya DV， DeLeon-Pennell KY. An offer we cannot refuse： cell-free DNA as a novel biomarker of myocardial infarction. Am J Med Sci，2018，356（2）：88-89.

[14] Vora NL， Johnson KL， Basu S， Catalano PM， Hauguel-De Mouzon S， Bianchi DW. A multifactorial relationship exists between total circulating cell-free DNA levels and maternal BMI. Prenat Diagn，2012，32（9）：912-914.

[15] Lehmann-Werman R， Neiman D， Zemmour H， Moss J， Magenheim J， Vaknin-Dembinsky A， Rubertsson S， Nellg?rd B， Blennow K， Zetterberg H， Spalding K， Haller MJ， Wasserfall CH， Schatz DA， Greenbaum CJ， Dorrell C， Grompe M， Zick A， Hubert A， Maoz M， Fendrich V， Bartsch DK， Golan T， Ben Sasson SA， Zamir G， Razin A， Cedar H， Shapiro AM， Glaser B， Shemer R， Dor Y. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（13）：E1826-E1834.

[16] Husseiny MI， Kaye A， Zebadua E， Kandeel F， Ferreri K. Tissue-specific methylation of human insulin gene and PCR assay for monitoring beta cell death. PLoS One，2014，9（4）：e94591.

[17] Akirav EM， Lebastchi J， Galvan EM， Henegariu O， Akirav M， Ablamunits V， Lizardi PM， Herold KC. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（47）：19018-19023.

[18] Zemmour H， Planer D， Magenheim J， Moss J， Neiman D， Gilon D， Korach A， Glaser B， Shemer R， Landesberg G， Dor Y. Non-invasive detection of human cardiomyocyte death using methylation patterns of circulating DNA，Nat Commun，2018，9（1）：1443.

[19] Roadmap Epigenomics Consortium， Kundaje A， Meuleman W， Ernst J， Bilenky M， Yen A， Heravi-Moussavi A， Kheradpour P， Zhang Z， Wang J， Ziller MJ， Amin V， Whitaker JW， Schultz MD， Ward LD， Sarkar A， Quon G， Sandstrom RS， Eaton ML， Wu YC， Pfenning AR， Wang X， Claussnitzer M， Liu Y， Coarfa C， Harris RA， Shoresh N， Epstein CB， Gjoneska E， Leung D， Xie W， Hawkins RD， Lister R， Hong C， Gascard P， Mungall AJ， Moore R， Chuah E， Tam A， Canfield TK， Hansen RS， Kaul R， Sabo PJ， Bansal MS， Carles A， Dixon JR， Farh KH， Feizi S， Karlic R， Kim AR， Kulkarni A， Li D， Lowdon R， Elliott G， Mercer TR， Neph SJ， Onuchic V， Polak P， Rajagopal N， Ray P， Sallari RC， Siebenthall KT， Sinnott-Armstrong NA， Stevens M， Thurman RE， Wu J， Zhang B， Zhou X， Beaudet AE， Boyer LA， De Jager PL， Farnham PJ， Fisher SJ， Haussler D， Jones SJ， Li W， Marra MA， McManus MT， Sunyaev S， Thomson JA， Tlsty TD， Tsai LH， Wang W， Waterland RA， Zhang MQ， Chadwick LH， Bernstein BE， Costello JF， Ecker JR， Hirst M， Meissner A， Milosavljevic A， Ren B， Stamatoyannopoulos JA， Wang T， Kellis M. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature，2015，518（7539）：317-330.

[20] Jing RR， Wang HM， Cui M， Fang MK， Qiu XJ， Wu XH， Qi J， Wang YG， Zhang LR， Zhu JH， Ju SQ. A sensitive method to quantify human cell-free circulating DNA in blood： relevance to myocardial infarction screening. Clin Biochem，2011，44（13）：1074-1079.

[21] Wickman A， Hammarsten O. Clearance of cardiac troponin T with and without kidney function. Clin Biochem，2017，50（9）：468-474.

[22] Nestelberger T， Boeddinghaus J， Wussler D， Twerenbold R， Badertscher P， Wildi K， Miró ?， López B， Martin-Sanchez FJ， Muzyk P， Koechlin L， Baumgartner B， Meier M， Troester V， Rubini Giménez M， Puelacher C， du Fay de Lavallaz J， Walter J， Kozhuharov N， Zimmermann T， Gualandro DM， Michou E， Potlukova E， Geigy N， Keller DI， Reichlin T， Mueller C; APACE Investigators. Predicting major adverse events in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol， 2019， 74（7）：842-854.

[23] Hickman PE， Potter JM， Aroney C， Koerbin G， Southcott E， Wu AH， Roberts MS. Cardiac troponin may be released by ischemia alone， without necrosis. Clin Chim Acta，2010，411（5-6）：318-323.

[24] Yi?it B， Boyle M， ?zler O， Erden N， Tutucu F， Hardy T， Bergmann C， Distler JHW， Adal? G， Dayanga? M， Mann DA， Zeybel M， Mann J. Plasma cell-free DNA methylation： a liquid biomarker of hepatic fibrosis. Gut，2018，67（10）：1907-1908.

[25] Luo H， Wei W， Ye Z， Zheng J， Xu RH. Liquid biopsy of methylation biomarkers in cell-free DNA. Trends Mol Med，2021，23：S1471-4914（21）00002-2.

（收稿日期：2020-12-14）

（本文編輯：楊江瑜）