鐘森杰，李 靜，邱 宏，程 彬，胡志希，李 琳

(湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所，長沙 410208)

參麥注射液是治療心腦血管疾病的常用中藥制劑，其主要成分為紅參和麥冬的提取液。本課題組前期研究結果表明，參麥注射液對高血壓心衰大鼠的療效顯著，能有效改善動物模型的心功能指標及心肌細胞結構，表現(xiàn)出多靶點的作用特點[1-2]。糞便代謝產(chǎn)物是腸道菌群和宿主共同代謝的結果，多項研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與高血壓、心衰等心血管疾病有著廣泛聯(lián)系，使得從糞便代謝產(chǎn)物中篩選生物標志物用于心血管疾病的診斷、生物靶向治療、預后監(jiān)測等成為可能[3-5]。本研究緊扣前沿熱點，運用液相色譜-質譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)的非靶向代謝組學技術，研究參麥注射液對高血壓心衰模型糞便代謝組學的影響，從生物學角度進一步闡明疾病的生物學基礎及藥物的干預機理。

1 材料

1.1 動物

雄性6周齡Dahl鹽敏感大鼠20只，體質量(220±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級實驗室。本實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理學批號20170906)。

1.2 主要儀器

ACQUITY型液相色譜儀、Xevo G2-XS QTof型質譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)；JXFSTPRP-24/32型樣品研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；CODA型型智能大鼠血壓計(美國Kent Scientific公司)；SB-5200DT型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；TYXH-I型漩渦振蕩器(上海汗諾儀器公司)；SonoScape-S2N型實驗動物彩超儀(深圳開立科技公司)；TGL-16MS型低溫離心機(上海盧湘儀儀器有限公司)。

1.3 主要試劑與藥物

本研究所用試劑由上海鹿明生物科技有限公司提供，具體批號及產(chǎn)家信息如下：L-2-氯苯丙氨酸(批號103616-89-3,上海恒創(chuàng)生物科技公司)；甲醇(批號CAEQ-4-003302-4000)、甲酸(批號CAEQ-4-00303-0050)、乙腈(批號CAEQ-4-00306-4000，均為上海安譜實驗科技有限公司)。參麥注射液(規(guī)格：20 mL/瓶，批準文號：國藥準字Z53021720，批號20190801，云南植物藥業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備

所用造模方法參考本課題組的前期報道[1-2]。所有大鼠給予普通飼料(0.3%NaCl濃度)適應喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為正常組(6只)、模型組(7只)和參麥注射液組(7只)。正常組繼續(xù)給予普通飼料飼養(yǎng)，模型組、參麥注射液組給予高鹽飼料(8%NaCl濃度)，每只每天飼料20 g，飲水量不限，共20周。飼養(yǎng)期間每2周檢測1次鼠尾血壓，以收縮壓高于140 mmHg為高血壓病的成模判定依據(jù)。飼養(yǎng)結束后對3組大鼠進行超聲心動圖檢查及血清NT-proBNP含量檢測，以左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)與左室短軸縮短率(fraction shortening,FS)顯著降低、NT-proBNP值顯著上升為心衰模型的判定依據(jù)。

2.2 分組給藥

造模結束后對參麥注射液組大鼠進行藥物干預。依據(jù)人與實驗動物的等效劑量換算，藥物的單次給藥劑量為6.0 mL/kg，腹腔注射每天1次共15 d。模型組注射同等劑量的滅菌注射用水。給藥結束后，對參麥注射液組和模型組大鼠進行超聲心動圖檢查及血清NT-proBNP含量檢測以觀察療效。

2.3 糞便樣本預處理

給藥結束后，運用糞便收集管收集各組大鼠的糞便樣本，保存于-80 ℃冰箱。上機檢測前對糞便樣本進行預處理，步驟如下：(1)取60 mg樣本，添加內標(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL；C-17，0.01 mg/mL)各20 μL和600 μL的甲醇∶水(V∶V=4∶1)；(2)加入2個小鋼珠，-20 ℃靜置2 min，加入研磨機中研磨(60 Hz，2min)；(3)超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min；(4)4℃12000 r/min離心10 min，取200 μL上清液，利用有機相針孔過濾器進行過濾，移至進樣瓶進行LC-MS上機檢測。

2.4 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱條件為ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7um)，柱溫維持在45 ℃；流動相：A-水、B-乙腈(均含0.1%甲酸)；流速保持0.4 mL/min，進樣體積5 μL。質譜條件：離子源：ESI；樣本的質譜信息收集運用正負離子掃描模式，正離子模式毛細管電壓設置為3kv，負離子模式設置為-2kv。

2.5 數(shù)據(jù)預處理

經(jīng)LC-MS分析后獲得原始數(shù)據(jù)，運用Progenesis QI v2.3程序對原始數(shù)據(jù)進行處理，包括基線過濾、峰識別與對齊、保留時間校正等。將正負離子數(shù)據(jù)合并，得到包括保留時間、離子模式和質核比等信息的數(shù)據(jù)矩陣用以后續(xù)分析。代謝物的鑒定基于精確質量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，使用 HMDB數(shù)據(jù)庫(The Human Metabolome Database)、Lipidmaps(v2.3)以及Metlin數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu)進行代謝物的鑒定分析。

2.6 統(tǒng)計學方法

將數(shù)據(jù)矩陣導入SIMCA14.0軟件進行主成分分析(principle component analysis,PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)，獲得對應的得分圖以區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異。差異代謝物的鑒定采用正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)，以OPLS-DA模型的變量重要性值(variable important in projection,VIP)大于1.2為條件，挖掘具有較強解釋能力的差異代謝物，并結合SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的t檢驗結果，以驗證組間差異代謝物是否具有顯著性。組間比較方式：模型組vs正常組、參麥注射液組vs模型組，選擇2組比較方式的共同差異變量。

3 結果

3.1 各組大鼠療效觀察結果

喂養(yǎng)20周后，模型組和參麥注射液組14只大鼠均成高血壓心衰模型，可用于后續(xù)藥物干預研究。經(jīng)參麥注射液干預15 d后，與模型組比較參麥注射液組大鼠的LVEF值和FS值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NT-proBNP值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖1)。

與模型組比較：**P<0.01圖1 藥物干預后大鼠LVEF、FS和NT-proBNP比較

3.2 各組大鼠基峰圖結果

LC-MS上機分析后將每個時間點質譜圖中最強的離子強度連續(xù)描繪并繪制基峰圖(base peak chromatogram，BPC)。圖2示，在正負離子模式下，3組大鼠的BPC。

圖2 正常組、模型組和參麥注射液組基峰圖(BPC)

3.3 各組大鼠PCA和PLS-DA分析結果

PCA得分圖可直觀觀察樣本間的總體分布趨勢，判斷可能存在的離散點；PLS-DA得分圖可直觀觀察樣本的分類效果和聚集程度。圖3示，正常組、模型組和參麥注射液組所有樣本點均位于95%置信區(qū)間內，3組在空間分布上完全分開且無交叉和重疊，分離程度好；圖4示，PLS-DA得分圖所有樣本點均位于95%置信區(qū)間內，3組的樣本點相互分開且互不重疊，組內聚集效果好，組間分離趨勢明顯，分類效果顯著。

注：EK為空白組(綠點)，EM為模型組(藍點)，ES為參麥注射液組(紅點)圖3 正常組、模型組和參麥注射液組大鼠偏最小二乘判別分析(PCA)得分圖

注：EK為空白組(綠點)，EM為模型組(藍點)，ES為參麥注射液組(紅點)圖4 正常組、模型組和參麥注射液組大鼠偏最小二乘判別分析(PCA)得分圖

3.4 各組大鼠差異代謝物篩選結果

為探求對分組貢獻較大的變量，以OPLS-DA模型中的分類重要性值VIP為篩選條件，鑒定出各組間有顯著差異的代謝物。以模型組大鼠出現(xiàn)紊亂的代謝物作為潛在藥物靶點，觀察參麥注射液干預后的代謝物變化情況。表1示，與模型組比較，參麥注射液組中神經(jīng)氨酸、別石膽酸、丙氨酰色氨酸、3,9-十六碳二烯酸、N-棕櫚酰酪氨酸、亞油基肉堿、3-羥基-順式-5-十四碳酰肉堿等7種代謝物表達水平顯著回調(P<0.05)，谷氨酸、?；敲撗跄懰帷⒓S甾烷酸、二十二碳六烯酸等4種代謝物表達水平呈回調趨勢。

4 討論

衰竭心臟的主要代謝特征在于產(chǎn)能底物利用的轉變，即由脂肪酸供能向糖類、氨基酸、酮體等物質供能轉變，此時氨基酸成為心臟產(chǎn)能的替代底物，故可見模型大鼠出現(xiàn)谷氨酸等氨基酸類物質水平紊亂[6-7]。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，氨基酸的異常直接影響蛋白質的合成，同時心臟結構與功能的損傷亦可擾動蛋白質代謝，體現(xiàn)為蛋白質水解的多肽類中間產(chǎn)物丙氨酰色氨酸水平紊亂。產(chǎn)能底物轉移是心衰發(fā)生發(fā)展的病理環(huán)節(jié)，但長期的底物轉移難以為心臟供給充足的能量，因此產(chǎn)能底物正?；蔀橹委熽P鍵[8]。本次研究結果表明，高血壓心衰病理過程中伴隨著氨基酸及其衍生產(chǎn)物的水平改變，參麥注射液可促使上述物質水平趨于正?；?，從而優(yōu)化衰竭心臟的能量供應。

肉堿是促進脂肪酸氧化成能量的關鍵物質，其廣泛存在于生物體內，其中心肌細胞線粒體較為豐富。細胞骨架影響著線粒體的結構，心肌結構改變可損傷細胞骨架，同時心衰時的多方面病理性因素都可引發(fā)線粒體的功能障礙[9]。線粒體損傷是衰竭心臟能量代謝障礙的核心，結構與功能改變必然導致模型大鼠的亞油基肉堿、3-羥基-順式-5-十四碳酰肉堿表達異常，致使能量合成途徑受抑制。隨著參麥注射液干預作用顯現(xiàn)，線粒體結構與功能逐步改善，心肌能量合成得以恢復，肉堿類物質水平回調。

前期運用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術發(fā)現(xiàn)，高血壓心衰大鼠血液中的膽固醇水平上升[10]。膽固醇在肝細胞中可合成膽酸、鵝脫氧膽酸和次級膽汁酸等物質，經(jīng)腸道微生物分解后生成少量石膽酸和脫氧膽酸，其與膽汁酸代謝存在密切關聯(lián)[11]。膽汁酸歸屬“腸-肝循環(huán)”系統(tǒng)，可于腸道中轉運脂類，膽汁酸的形成是促進血液中膽固醇清除的重要途徑。體內膽固醇堆積過多，肝細胞功能受損，引發(fā)膽汁酸“腸-肝循環(huán)”障礙，因此可見模型大鼠糞便中的別石膽酸、?；敲撗跄懰帷⒓S甾烷酸水平紊亂。經(jīng)參麥注射液干預后，經(jīng)由糞便排出的膽汁酸類物質表達回調，提示藥物通過調控膽汁酸代謝以清除體內過多的膽固醇，調節(jié)脂質堆積。

表1 組間差異代謝物篩選結果比較

3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸均屬于不飽和脂肪酸，異常的不飽和脂肪酸代謝是眾多心血管疾病的潛在生物標志物[12-13]。由腸道微生物代謝生成的脂肪酸可經(jīng)由G蛋白偶聯(lián)受體進入體內，從而參與生物體的脂代謝紊亂過程。參麥注射液通過回調不飽和脂肪酸的異常表達，可促使膽固醇酯化，降低血液中膽固醇和甘油三脂含量，繼而發(fā)揮對心臟等靶器官的保護效應[14]。

神經(jīng)氨酸是丙酮酸和N-乙酰氨基甘露糖的醇醛縮合產(chǎn)物，一般不以游離形式存在，該物質在心衰模型中的異常表達機制仍有待進一步探討。值得注意的是，肉堿類、3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸等物質主要來源于膳食補充，如二十二碳六烯酸在生物體內雖可經(jīng)α-亞麻酸代謝生成，但生成量甚少，難以滿足機體需求。結合前文的膽汁酸“腸-肝循環(huán)”障礙，這部分紊亂的物質提示模型存在腸道穩(wěn)態(tài)失衡，而對腸道功能的調節(jié)可能是參麥注射液治療高血壓心衰的有效靶點，其具體機制有待更為深入的研究。

本研究以糞便代謝組學為切入點，發(fā)現(xiàn)參麥注射液通過調控氨基酸及其衍生產(chǎn)物、肉堿類物質水平以優(yōu)化能量代謝，這將有助于改善心功能，延緩心衰進展，與前期結果存在共性[15-16]；另一方面可通過調節(jié)膽汁酸代謝、不飽和脂肪酸代謝以改善體內的脂代謝紊亂。綜上所述，參麥注射液干預高血壓心衰的機制涉及優(yōu)化氨基酸代謝、蛋白質代謝、肉堿代謝、膽汁酸代謝、脂質代謝等多個層面，在后續(xù)研究中可結合腸道微生態(tài)及靶向代謝組學等研究方法，深入闡明心衰與腸道微生態(tài)之間的聯(lián)系，以期獲得更為豐富的結果。