黃 晗，李鳳芝，李 楊，張小紅

靈芝多糖對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能及TLR4/NF-κB通路的影響

黃 晗，李鳳芝，李 楊，張小紅*

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450000

探究靈芝多糖對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔導(dǎo)致的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能及肺組織炎癥的影響。SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組及靈芝多糖低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和烏司他丁組，除對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型。給予靈芝多糖和烏司他丁進(jìn)行干預(yù)，采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)大鼠O2分壓[(O2)]和CO2分壓[(CO2)]；取大鼠右肺中葉計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量；采用ELISA法檢測(cè)大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測(cè)大鼠肺組織病理變化；采用Western blotting法檢測(cè)大鼠肺臟組織中Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）、p65、磷酸化p65（p-p65）蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織炎癥評(píng)分顯著升高（＜0.05）；肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量顯著升高（＜0.05）；(CO2) 顯著升高（＜0.05），(O2) 顯著降低（＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著升高（＜0.05）；肺組織TLR4和p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織損傷減輕，肺泡完整性較好，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺組織炎癥評(píng)分顯著降低（＜0.05）；肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量顯著降低（＜0.05）；(CO2)顯著降低（＜0.05），(O2) 顯著升高（＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低（＜0.05）；肺組織TLR4和p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，從而減輕膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)并保護(hù)肺功能。

靈芝多糖；膿毒癥；炎癥反應(yīng)；Toll樣受體4；核因子-κB

膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，患者嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)器官功能障礙[1]。肺臟是膿毒癥患者最易受到損傷的器官之一。膿毒癥可以引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI），肺組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫炎癥反應(yīng)失衡[2-4]。Toll樣受體4（toll like receptors 4，TLR4）為Toll樣受體亞型之一，可通過促進(jìn)其下游靶點(diǎn)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）磷酸化活化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路可減輕炎癥反應(yīng)，改善膿毒癥肺損傷[5]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗炎等作用[6-7]。靈芝多糖可通過抑制ApoE?/?動(dòng)脈粥樣硬化小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮調(diào)血脂作用[8]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備大鼠膿毒癥模型，觀察靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺功能的影響，并探討其對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，以期為其治療膿毒癥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)SYXK（浙）2019-0024。動(dòng)物于鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，通風(fēng)良好、溫度25 ℃、相對(duì)濕度50%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZZCH-LL-2020072402）。

1.2 藥品與試劑

烏司他丁注射液（5×104U/mL）購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；靈芝多糖對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%，批號(hào)180516）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號(hào)190118）、IL-1β試劑盒（批號(hào)180925）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、NF-κB試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；TLR4抗體、p65抗體、p-p65抗體、β-actin抗體、羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

GEM3500型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x（美國(guó)沃芬有限公司）；GL224/224i-1SCN型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；MK3 Multiskan型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-25D型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；無(wú)創(chuàng)肺功能儀（法國(guó)EMKA公司）。

2 方法

2.1 膿毒癥模型的制備

隨機(jī)選取12只SD大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法[9]制備膿毒癥模型。大鼠ip 1.0%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，腹部消毒脫毛，沿正中腹白線切開皮膚，打開腹腔，找出盲腸，結(jié)扎盲腸末端和回盲瓣中間部位，使用18號(hào)針頭在盲腸結(jié)扎處做2處穿刺，輕輕擠壓盲腸，擠出部分腸內(nèi)容物至腹腔，盲腸放入腹腔，逐層縫合，關(guān)閉腹腔。術(shù)后，大鼠sc生理鹽水（30 mL/kg）進(jìn)行液體復(fù)蘇。對(duì)照組大鼠僅打開腹腔，游離盲腸，不結(jié)扎穿孔。膿毒癥大鼠模型制備成功后，檢測(cè)大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)如潮氣量（tidal volume，T）、呼氣峰流量（peak expiratory flow，PET），保證膿毒癥大鼠模型造成了大鼠肺功能損傷。

2.2 分組與給藥

按照文獻(xiàn)方法[10-11]，將膿毒癥模型大鼠隨機(jī)分為模型組及靈芝多糖低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和烏司他丁組，每組12只。靈芝多糖溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 g/mL的溶液。靈芝多糖組大鼠ig相應(yīng)藥物，烏司他丁組大鼠ip藥物（3 mL/kg），對(duì)照組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

2.3 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量的影響

大鼠處死后，完整摘除肺組織。取大鼠右肺中葉，吸干表面水分，稱定濕質(zhì)量，于60 ℃烘箱中烘干48 h，稱定干質(zhì)量，計(jì)算肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量。

2.4 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠O2分壓[p(O2)]和CO2分壓[p(CO2)]的影響

末次給藥24 h后，大鼠麻醉處死，頸總動(dòng)脈取血并加入肝素抗凝，使用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)(O2) 和(CO2)。

2.5 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響

大鼠處死后，打開胸腔，結(jié)扎右側(cè)肺部，在近頭端氣管位置，將預(yù)冷生理鹽水緩慢注入大鼠左側(cè)肺泡內(nèi)，然后緩慢抽出，重復(fù)3次，將收集的肺泡灌洗液離心取上清，于?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平。

2.6 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響

取大鼠右肺組織，于4%多聚甲醛中固定，脫水透明、浸蠟包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理變化，并對(duì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；3分為部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；5分為大量炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。

2.7 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取大鼠右肺組織，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的裂解液，研磨混勻，離心取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入脫脂牛奶封閉2 h；分別加入TLR4、p65、p-p65、β-actin抗體（1∶1000），孵育過夜，洗滌后加入羊抗兔IgG抗體，室溫孵育2 h，洗滌后加入顯影液，拍照并觀察。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量明顯降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

表1 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量的影響(, n = 12)

與對(duì)照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05；與靈芝多糖50 mg/kg組比較：▲＜0.05；與靈芝多糖100 mg/kg組比較：■＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05model group;▲< 0.05polysaccharide 50 mg/kg group;■< 0.05polysaccharide 100 mg/kg group, same as below tables

3.2 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠p(O2) 和p(CO2) 的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠(O2) 顯著降低（＜0.05）、(CO2) 顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠(O2) 顯著升高（＜0.05）、(CO2) 顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

表2 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠p(O2)和p(CO2)的影響(, n = 12)

1 mm Hg＝133 Pa

3.3 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.4 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響

如圖1所示，對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰且間隔均一，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組大鼠肺組織損傷較模型組減輕，肺泡完整性較好，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

表3 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響(, n = 12)

圖1 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響(HE, ×200)

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織炎癥評(píng)分顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織炎癥評(píng)分顯著降低（＜0.05）。

表4 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響(, n = 12)

3.5 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2和表5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織TLR4、p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

圖2 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 靈芝多糖對(duì)膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 12)

4 討論

膿毒癥是由感染引起的全身反應(yīng)，是潛在的致命并發(fā)癥[12-14]。膿毒癥早期表現(xiàn)為大量促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生全身性炎癥，先天免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌感染產(chǎn)生異常強(qiáng)烈反應(yīng)[15]。膿毒癥后期存在廣泛的器官功能障礙，肺臟是其主要靶器官[16-17]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織炎癥評(píng)分、肺組織濕/干質(zhì)量顯著升高，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平顯著升高，(CO2) 顯著升高，(O2) 顯著降低，表明模型組大鼠肺組織嚴(yán)重破壞，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，肺功能障礙，膿毒癥模型建立成功。

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，常用于扶正固本、增強(qiáng)身體抵抗能力[8]。靈芝多糖作為靈芝的主要有效成分，可抑制炎癥反應(yīng)、緩解機(jī)體損傷[18]。靈芝多糖可通過抑制肝臟組織Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕急性酒精性肝損傷小鼠的炎癥反應(yīng)，有效緩解肝組織損傷并恢復(fù)肝功能[19]。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織損傷減輕，肺泡完整性較好，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺組織濕/干質(zhì)量、(CO2)降低，(O2) 升高，表明靈芝多糖能夠改善膿毒癥大鼠肺損傷，保護(hù)肺功能。靈芝多糖可顯著降低腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，減輕大鼠腦缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織炎癥評(píng)分顯著降低，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低，且呈劑量相關(guān)性，表明靈芝多糖可通過抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)膿毒癥大鼠肺組織。

研究表明，TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)，姜黃素和升降散可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕膿毒癥大鼠的腸損傷炎癥反應(yīng)和心肌損害[21-22]；紫杉醇可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中TLR4、p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明膿毒癥大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)和肺損傷可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。羧甲基化靈芝多糖可抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織中NF-κB表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織中TLR4和p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量相關(guān)性，表明靈芝多糖可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)。綜上所述，靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/ NF-κB信號(hào)通路，從而抑制膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)并保護(hù)肺臟功能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofpolysaccharides on lung function and TLR4/NF-κB pathway in sepsis rats with acute lung injury

HUANG Han, LI Feng-zhi, LI Yang, ZHANG Xiao-hong

Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China

To explore the effect ofpolysaccharides (GLP) on lung function and lung tissue inflammation in rats with septic acute lung injury caused by cecal ligation and perforation.SD rats were randomly divided into control group, model group, low-, medium-, high-dose (50, 100, 200 mg/kg) GLP groups and ulinastatin group. Except for rats in control group, rats in the other groups were used to establish sepsis model by cecal ligation and perforation method. GLP and ulinastatin were given to intervene, and(O2) and(CO2) of rats were detected by automatic blood gas analyzer; Middle lobe of the right lung of rats was taken to calculate the wet/dry weight of lung tissue; Levels of interleukin-6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and nuclear factor-κB (NF-κB) in alveolar lavage fluid of rats were detected by ELISA; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect pathological changes in rat lung tissue; Western blotting was used to detect expressions of toll like receptor 4 (TLR4), p65, and phosphorylated p65 (p-p65) in lung tissue of rats.Compared with control group, lung tissue structure of rats in model group was destroyed, the alveolar compartment was significantly thickened, with a large number of inflammatory cells infiltration, and the lung tissue inflammation score was significantly increased (< 0.05); Wet/dry weight of lung tissue was significantly increased (< 0.05);(CO2) was significantly increased (< 0.05),(O2) was significantly decreased (< 0.05); IL-6, IL-1β, TNF-α and NF-κB levels in alveolar lavage fluid were significantly increased (< 0.05); Expressions of TLR4 and p-p65/p65 in lung tissue were significantly increased (< 0.05). Compared with model group, lung tissue damage of rats in GLP group was reduced, alveolar integrity was improved, inflammatory cell infiltration was reduced, lung inflammation scores was significantly reduced (< 0.05); Wet/dry weight of lung tissue was significantly reduced (< 0.05);(CO2) was significantly reduced (< 0.05),(O2) was significantly increased (< 0.05); IL-6, IL-1β, TNF-α and NF-κB levels in alveolar lavage fluid were significant decreased (< 0.05); Expressions of TLR4 and p-p65/p65 in lung tissue were significantly reduced (< 0.05), in a dose-dependent manner.GLP can inhibit TLR4/NF-κB signaling pathway, thereby reducing the inflammatory response in septic rats and protecting lung function.

polysaccharide; sepsis; inflammatory reaction; TLR4; NF-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2351 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.018

2020-10-20

黃 晗，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)方面研究。E-mail: hh901238@163.com

張小紅，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: zhangxh1970@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]