馬麗莎，單奇，謝文平，尹怡，劉書貴，李麗春，趙成，鄭光明

(中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業(yè)農村部水產品質量安全風險評估實驗室(廣州)，農業(yè)農村部休閑漁業(yè)重點實驗室， 廣東 廣州 510380)

氟蟲腈(fipronil)是苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑，可阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝[1]，被廣泛用于水稻等多種經(jīng)濟作物的蟲害防治中[2]。但氟蟲腈及其代謝產物氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氟蟲腈亞砜(fipronil sulfide)和氟蟲腈砜(fipronil sulfone)等具有高毒、高殘留及“三致”(致畸、致癌、致突變)等副作用[3-5]，目前已被歐盟禁止用于人類食品產業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程，中國也限制了氟蟲腈的銷售和使用[6]。由于氟蟲腈具有殺蟲效果好、價格低廉等優(yōu)點，生產實踐中仍存在違規(guī)使用的問題，歐盟食品和飼料快速報警系統(tǒng)[7]顯示,近年來中國出口茶葉曾多次因氟蟲腈農殘超標被通報, 2017年歐盟爆發(fā)的“毒雞蛋”事件更將食品中氟蟲腈及其代謝物殘留問題推上了食品安全的風口浪尖。

鑒于殘留在環(huán)境中的氟蟲腈半衰期長[8]且極難降解[9]，而水產養(yǎng)殖又為環(huán)境依賴型產業(yè)[10]，因此中國水產品可能存在氟蟲腈污染的潛在風險，浙江沿海海產品[11]中有檢出氟蟲腈及其代謝物殘留的報道。而殘留是影響食品安全的重要因素，藥物代謝與殘留消除規(guī)律研究是避免殘留的科技基礎，肝臟是體內藥物代謝的重要場所，故建立鯉(Cyprinuscarpio)肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測方法，有助于進一步開展鯉肝臟中氟蟲腈藥物代謝及殘留消除規(guī)律的研究。

目前，氟蟲腈及其代謝物的測定方法較多，包括液相色譜(LC)[12]、氣相色譜(GC)[13-14]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS)[15-16]等。液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)因靈敏度高、抗干擾能力強的優(yōu)點被廣泛應用于氟蟲腈及其代謝物的測定[17-19]，而這些方法主要針對的是陸生動物源性食品、蔬菜水果及雞蛋等食品中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測，Zhang等[11]建立了測定海產品中氟蟲腈及其代謝物殘留的UHPLC-MS/MS法，但僅適用于水產品肌肉中的檢測，尚無魚肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測方法的報道。QuEChERS具有快速、簡單、高效及價廉等優(yōu)點，被廣泛用于水產品中藥物殘留的檢測[20-22]。本研究改進了QuEChERS提取凈化方法，并利用液相色譜串聯(lián)質譜定量分析靈敏度高的優(yōu)勢，建立了QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質譜法測定鯉肝臟中的氟蟲腈及其代謝物殘留，該方法準確、快速、耗溶劑少且成本低，單個樣品前處理時間僅需20 min，可實現(xiàn)樣品的批量化處理，可為鯉肝臟中氟蟲腈藥物代謝及殘留消除規(guī)律的研究提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470 三重四極桿液質聯(lián)用儀，美國Agilent科技公司；IKA MS3 basic渦旋振蕩儀，德國IKA公司；TDL-5-A飛鴿牌離心機，中國上海安亭公司；高速離心機，美國Sigma公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器，美國Millipore公司；玻璃勻漿器，南京奧多福尼生物科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA 40～60目)、石墨化炭黑(GCB)及中性氧化鋁(Alumina-N)，美國Agela公司；無水硫酸鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司，500 ℃灼燒4 h,冷卻后儲存于磨口玻璃瓶中備用。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜標準物質，純度均大于99 %，德國Dr．Ehrenstorfor 公司；乙腈、甲酸、正己烷，均為色譜純，美國霍尼韋爾公司；實驗用水為Milii-Q去離子水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準儲備液的配制

分別稱取適量的標準物質，用乙腈溶解，配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2 混合標準溶液的配制

分別移取適量的標準儲備液，用乙腈配制成10 μg/mL的混合標準溶液，于-18 ℃避光保存。

1.2.3 空白基質提取液

樣品按照1.3節(jié)條件前處理后上機檢測，當4種目標物的定性與定量離子信噪比均小于3時，樣品確定為空白基質?？瞻谆|按照1.3節(jié)條件前處理，獲得空白基質提取液。

1.2.4 基質標準工作溶液的配制

量取一定體積的混合標準溶液，用空白基質提取液稀釋成適用濃度的基質標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

實驗所用鯉購自水產品批發(fā)市場，取其肝臟，將肝臟裝入密實袋， -20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.2 提取

準確稱取1.0 g肝臟樣品于10 mL玻璃勻漿器中，加入0.5 g無水硫酸鈉與5 mL 0.1%甲酸乙腈，勻漿2 min，將勻漿液轉入10 mL具塞離心管中，5 000 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.3 凈化

分取1 mL上清液于2 mL玻璃離心管中，加入150 mg中性氧化鋁、50 mg PSA及10 mg GCB,漩渦震蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜，供HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜質譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Extend-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：A液為0.05%氨水，B液為乙腈；梯度洗脫條件：0～1 min，30% B；1～15 min，30%～60% B；15～17min，60%～30% B；進樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min。

1.4.2 質譜條件

電噴霧電離負離子源(ESI-)；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化氣壓力：45 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流量為12 L/min；毛細管電壓為3 500 V。氟蟲腈及其代謝物的詳細質譜參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物的化學結構中均含有-NH2基團，在負離子模式下易失去H而形成準分子離子。實驗分別取1 mL質量濃度為1 mg/L的4種標準工作溶液利用流動注射泵進樣，在負離子模式下對4種目標物進行母離子掃描,確定各組分的母離子，以化合物的離子峰為母離子，通過優(yōu)化最佳碰撞能，進而確定化合物的定量離子和定性離子，同時對碎裂電壓、毛細管電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳離子源測定條件(表1)。LC-MS/MS分析時發(fā)現(xiàn)離子駐留時間對目標峰的峰形及靈敏度影響較大。駐留時間過短，檢測器的相對誤差變大，可影響靈敏度；但駐留時間過長，會導致峰失真且重現(xiàn)性差，影響定性準確性。通過試驗，本研究確定各監(jiān)測離子的駐留時間為30 ms，此時，4種化合物的響應及峰形均最佳。

表1 氟蟲腈及其代謝物質譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometric(MS) parameters for detection of fipronil and its metabolites

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物為酸性化合物在質譜上以電噴霧負離子電離源(ESI-)檢測，通常ESI-檢測時流動相中加入氨水可促進化合物電離以增強質譜響應從而提高儀器靈敏度，實驗選用安捷倫ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱分離目標物，該色譜柱使用雙配位鍵合相和雙封端技術保證了高pH值時的穩(wěn)定性，非常適合于堿性環(huán)境下分離酸性物質，分別比較了3組流動相在1.4.1節(jié)流動相梯度條件下的色譜行為：組1中A為水溶液，B為甲醇；組2中A為水溶液，B為乙腈；組3中A為 0.05% 氨水溶液，B為乙腈。結果表明，在乙腈-0.05% 氨水溶液體系下，通過梯度洗脫，氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈的峰形最佳、化合物響應值最高，水-甲醇體系下化合物色譜峰分離度及響應重現(xiàn)性均較差且系統(tǒng)壓力大，故選擇0.05%氨水溶液-乙腈為流動相。

2.3 提取方法及提取溶液的選擇

實驗將鯉肝臟放入裝有提取液的玻璃勻漿器中研磨粉碎，研磨時肝臟組織被破碎、分散，保證了萃取液與提取溶劑的充分接觸，該方法集均質、萃取于一體，不僅提高了溶劑的提取效率，還簡化了實驗步驟，具有省時、省力及高效的優(yōu)點。

圖1 不同提取溶劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of fipronil and its metabolites

根據(jù)相似相容原理，乙腈與氟蟲腈及其代謝物含相同的-CN基團，易將目標化合物提取出來，乙腈可沉淀蛋白且對魚肝臟中的脂溶性色素、脂肪等非極性成分的提取能力較弱，利于樣品后續(xù)凈化，因此，實驗選擇乙腈為提取溶液，考慮到氟蟲腈及其代謝物是酸性物質，在提取劑乙腈中加入甲酸可抑制目標物解離，提高溶解度。實驗考察了體積分數(shù)為0.1%、0.3%、0.6%及1.0%甲酸酸化乙腈的提取效率(圖1)。結果表明，0.1%甲酸乙腈的萃取效率最佳，4種目標物的回收率均在80%～110%之間，隨提取液中甲酸含量的增加，氟蟲腈亞砜的回收率下降明顯，回收率小于70%。分析原因：實驗時觀察到提取液的顏色隨著甲酸含量的增加逐漸加深，表明其中所含雜質增多，而雜質可干擾目標物離子化、增大基質效應從而影響回收率，同時可能由于化合物性質不同，抗干擾的能力也不同，故氟蟲腈亞砜回收率下降明顯，而雜質的增多對其他目標物回收率影響不明顯。此外，魚肝臟中含大量水分，提取劑乙腈與水部分互溶可影響提取效率，故實驗比較了無水Na2SO4與無水MgSO4的除水效果，發(fā)現(xiàn)無水MgSO4可吸附目標物，而無水NaSO4對目標物無吸附。因此，實驗選用0.1%甲酸乙腈作為本方法的提取液，并在均質時加入0.5 g無水Na2SO4以除去肝臟組織中多余的水分。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

魚肝臟成分復雜，含大量水分、蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素與色素。本研究采用QuEChERS方法利用吸附劑中性氧化鋁去除肝臟提取液中的脂肪和脂類等非極性有機物，PSA去除極性物質、脂肪酸、有機酸等雜質及少數(shù)色素，石墨化炭黑(GCB)去除色素和甾醇等，并考察了上述3種吸附劑不同質量水平及不同比例對回收率的影響：當PSA為200 mg、GCB為25 mg時，4種目標物的回收率在中性氧化鋁加入量為150 mg時達最佳值，均在90%左右(圖2A)，故選擇中性氧化鋁加入量為150 mg；當中性氧化鋁為150 mg、GCB為25 mg及PSA為50 mg時，4種目標物回收率均在85%以上，且PSA對氟蟲氰砜回收率的影響較大，其回收率隨PSA含量的增加逐漸降低，但對其余3種目標物回收率的影響不明顯，這可能與化合物性質不同有關，PSA含量的增加可吸附氟蟲氰砜導致其回收率下降顯著，但對其他3種目標物影響不大，故選擇PSA加入量為50 mg(圖2B)；吸附劑中GCB含量的增加對4種目標物回收率的影響均不明顯，回收率在90%左右，表明10 mg GCB的加入量已能滿足實驗需求，最終確定組合條件為中性氧化鋁150 mg+PSA 50 mg+GCB 10 mg用于樣品前處理，凈化后的肝臟提取液澄清透亮、基線平穩(wěn)，目標化合物附近無干擾峰，表明該方法適合肝臟提取液的凈化。

圖2 不同吸附劑、不同用量及不同比例對回收率的影響A:弗羅里硅土；B:PSA；C: GCB。Fig.2 Effects of different sorbents, dosages and proportions on the recoveries of fipronil and its metabolitesA:Florida silica；B:PSA；C: GCB.

2.5 方法學考察

2.5.1 基質效應

采用液相色譜-質譜聯(lián)用法分析時普遍存在基質效應，基質效應可導致目標化合物發(fā)生離子增強或抑制作用，從而影響定量分析的準確性和重現(xiàn)性。實驗配制5 μg/L的基質標準溶液，與同等濃度的溶劑標準溶液進行對比測定，采用公式ME=空白基質標準響應值/純溶劑標準響應值×100%，評價氟蟲腈及其代謝物在鯉肝臟中的基質效應。當ME>1時，為基質增強效應；當ME<1時，為基質抑制效應；當ME=1時，無基質效應。一般情況下，ME在80%～120%內為正常的范圍[23]。結果表明，氟蟲腈及其代謝物在鯉肝臟中的基質效應在92.2%～116.0%之間(見表2)，說明基質對信號均呈增強作用，因此采用配制基質匹配標準曲線的方法降低基質效應提高定量分析的準確性。

2.5.2 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化的分析條件下，用空白鯉肝臟萃取基質分別配制質量濃度為0.4、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的氟蟲腈及其代謝物混合標準溶液，經(jīng)HPLC-MS/MS測定后，以農藥定量離子峰面積(y)為縱坐標，農藥基質標準溶液質量濃度為(x, ng/ml)橫坐標，繪制標準曲線。利用肝臟的空白基質，通過氟蟲腈及其代謝物標準物的添加，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。氟蟲腈及其代謝物在0.4～100.0 ng/mL線性范圍內，線性良好，線性相關系數(shù)(r2)均大于0.997，檢出限為2.0 μg/kg,定量限為5.0 μg/kg(表2)，遠低于GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中所規(guī)定氟蟲腈在禽類內臟中的最大殘留限量20.0 μg/kg[24]。

2.5.3 回收率與精密度

以空白鯉肝臟為基質進行加標回收實驗，添加濃度分別為10、20及40 μg/kg，每個添加濃度設6個平行，并做空白實驗，采用基質匹配標準曲線進行定量分析，結果見(表3)。4種化合物的平均加標回收率在87.3%～109.2%之間，相對標準偏差在1.3%～12.0%之間，均小于15.0%，表明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性，符合痕量分析的要求，添加回收色譜圖(圖3)。

表2 氟蟲腈及其代謝物在肝臟基質中的回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Tab.2 Regression equation, correlation coefficients(r2), limits of detection(LODs), limits of quantitation(LOQs) of fipronil and its metabolites in the liver matrix

表3 鯉肝臟中4種農藥的回收率和精密度Tab.3 Average recovery and precision of 4 kinds of pesticides in the liver tissue of carp n=6

圖3 加標魚肝臟樣品中氟甲腈(A)、氟蟲腈(B)、氟蟲腈砜(C)和氟蟲腈亞砜(D)提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of the standard addition of fipronil and its metabolites in the liver tissue of carp

3 樣品測定

運用本研究建立的方法對市售的鯉、鯽(Carassiusauratus)各10份肝臟樣品進行檢測，所有樣品均未檢出氟蟲腈及其代謝物殘留。

4 結論

本研究建立了魚肝臟中氟蟲腈及其代謝物的QuEChERS/LC-MS/MS聯(lián)用法，通過對實驗條件的篩選和優(yōu)化，確定了萃取試劑、凈化方法等樣品前處理條件及儀器分析參數(shù)，方法快速、準確、簡便、環(huán)保且節(jié)約，適用于魚肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測，可為魚肝臟中氟蟲腈藥物代謝及殘留消除規(guī)律的研究提供技術支撐。