溫慧嬌，沈 群

(南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

中藥炮制和復(fù)方配伍是中醫(yī)用藥的兩大特色。目前，關(guān)于單味中藥炮制機(jī)理的研究較多，卻少有將炮制和復(fù)方進(jìn)行整合研究，系統(tǒng)地闡明炮制對復(fù)方中藥效的影響及其物質(zhì)基礎(chǔ)。脫離復(fù)方的單味中藥炮制研究，難以反映炮制在復(fù)方中的作用，如有研究[1-3]表明：地黃生熟異用對四物湯的免疫功能、抗過敏作用和增強(qiáng)家蠶壽命的影響均有顯著性差異，但為什么會影響這些功能變化，物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生了什么改變等不得而知。因此，有必要探索炮制對復(fù)方化學(xué)成分影響的研究。

四物湯為臨床補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)的經(jīng)典名方，最早記載于唐藺道人著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》[4]：“凡傷重，腸內(nèi)有瘀血者用此，白芍藥、當(dāng)歸、熟地黃、川芎各等分，每服三錢，水一盞半。”我國第一部成藥制劑規(guī)范宋《太平惠民和劑局方》中記載[5]：“當(dāng)歸(去蘆，酒浸，炒)、川芎、白芍藥、熟干地黃(酒灑蒸)，各等分?！崩^續(xù)查閱明《醫(yī)方考》[6]、《仁術(shù)便覽》[7]等則均顯示四物湯中的當(dāng)歸(酒洗)、白芍(酒炒)需要經(jīng)過酒制處理。現(xiàn)代研究[8]證實(shí)，川芎、當(dāng)歸酒制后都能增強(qiáng)活血行氣止痛的功效；酒白芍比生白芍更善于柔肝止痛、調(diào)經(jīng)止血，因此酒制處理四物湯復(fù)方中的白芍、川芎和當(dāng)歸可能更加適合四物湯的補(bǔ)血活血調(diào)經(jīng)作用。

本文以白芍中的芍藥苷、當(dāng)歸和川芎中的阿魏酸，熟地黃中的5-羥甲基糠醛(5-HMF)作為主要研究指標(biāo)，從化學(xué)成分的含量變化來探討酒制對四物湯復(fù)方中化學(xué)成分的影響，為研究中藥炮制與復(fù)方的關(guān)系提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-100)；超高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；安捷倫1290高效液相色譜儀。

1.2 試藥

試劑：乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(廣州市金華大化學(xué)有限公司，分析純)。

對照品：芍藥苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；阿魏酸(上海源葉生物科技有限公司)；5-羥甲基糠醛(柏吉生物科技有限公司)。

中藥飲片：熟地黃(批號：S7518316)、當(dāng)歸(批號：S7518316)、川芎(批號：C4518911)、白芍(批號：B4118311)，均來自廣東省藥材公司中藥飲片廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的檢測方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Ecosil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相：乙腈(A)-0.5%磷酸水(B)，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：8 μL，梯度洗脫程序見表1。5-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸最大吸收波長分別為284 nm、232 nm、324 nm，變檢測波長程序見表2。

表1 梯度洗脫的程序

表2 變檢測波長的程序

2.1.2 混合對照品溶液制備 精密稱定適量對照品5-羥甲基糠醛、阿魏酸、芍藥苷，用50%甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.1.3 供試品溶液制備 生當(dāng)歸、生川芎、生白芍飲片分別打粉，過20目篩，熟地剪碎。精密稱定各2.5 g置于錐形瓶中，準(zhǔn)確量取50%甲醇溶液100 mL加入錐形瓶，用封口膜封口，稱重，超聲(功率：100 KW；頻率：40 KHz)提取1 h，冷卻至室溫，稱重并用50%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻。取適量提取液離心，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，時間5 min。取適量上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.1.4 陰性對照溶液制備 取對應(yīng)的飲片各2.5 g，按照“2.1.3”項下超聲提取法處理，分別制備缺熟地、川芎、白芍、當(dāng)歸與川芎的陰性對照溶液a、b、c、d，備用。

2.1.5 線性與范圍 取適量混合對照品溶液進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得到工作曲線和范圍，見表3。

表3 對照品的工作曲線和范圍

2.1.6 精密度 精密吸取混合對照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，5-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸的峰面積RSD值分別為0.25%、0.18%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重現(xiàn)性 按照“2.1.3”項下超聲提取法處理得到6份供試品進(jìn)樣分析，5-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸的峰面積RSD值分別為1.10%、2.70%、1.38%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性 取上述供試品溶液，在放置0、4、8、12、16h后分別進(jìn)樣測定，記錄各待測成分色譜峰的峰面積，5-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸的RSD值分別為2.70%、0.77%、0.39%，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率 分別精密吸取己知含量的供試品溶液適量，共18份，精密添加芍藥苷、阿魏酸、5-羥甲基糠醛對照品溶液，定容至5mL容量瓶中，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率。數(shù)據(jù)見表4。

表4 加樣回收率數(shù)據(jù)

2.2 炮制品制備

按照《中國藥典》酒制要求，取生當(dāng)歸、生川芎、生白芍飲片分別大小分檔，加入黃酒(每100 kg加入1.5 kg)拌勻，稍悶潤，待黃酒被吸盡，置預(yù)熱好的炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒至深黃色，取出放涼，分別為酒當(dāng)歸、酒川芎、酒白芍。

2.3 正交試驗設(shè)計

選取白芍、當(dāng)歸、川芎作為實(shí)驗因素，分別用A、B、C表示；每個因素的生品或酒制品作為兩水平，用1、2表示。熟地作為炮制品，不作為因素研究。正交設(shè)計見表5。

表5 L4(23)正交設(shè)計

按照表5進(jìn)行實(shí)驗，以2號為例：精密稱定熟地、生白芍、酒當(dāng)歸、酒川芎各2.5 g置于錐形瓶中，按照“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法處理，以此類推，每號實(shí)驗重復(fù)1次，制備各組樣品溶液。

2.4 樣品含量測定

混合對照品、供試品、陰性對照溶液按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1、圖2、圖3?？梢?-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸各自的色譜峰分離度R>1.5，且三者的響應(yīng)沒有受到干擾組分的影響。

(1：5-羥甲基糠醛；2：芍藥苷；3：阿魏酸)

(1：5-羥甲基糠醛；2：芍藥苷；3：阿魏酸)

陰性對照a(缺熟地)、陰性對照b(缺川芎)、陰性對照c(缺白芍)、陰性對照d(缺當(dāng)歸與川芎)(1：5-羥甲基糠醛；2：芍藥苷；3：阿魏酸)

按照“2.1.1”項下色譜條件測定正交試驗設(shè)計制備的各組樣品溶液中的5-羥甲基糠醛、芍藥苷、阿魏酸的含量，具體數(shù)據(jù)及直觀分析見表6，方差分析結(jié)果見表7?？梢姀?fù)方中阿魏酸的含量變化有顯著性差異。

2.5 對比驗證實(shí)驗

2.5.1 生白芍組溶液的制備 精密稱定熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎各2.5 g，置于錐形瓶中，精密吸取50%甲醇100 mL，密塞，稱重，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱重并補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。平行3份。

2.5.2 酒白芍組溶液的制備 精密稱定熟地、當(dāng)歸、酒白芍、川芎各2.5 g，其余與生白芍組溶液的制備方法一致，制成酒白芍組溶液，平行3份。

分別精密吸取生白芍組溶液和酒白芍組溶液注入液相色譜儀，測定各組的阿魏酸含量，具體數(shù)據(jù)與處理結(jié)果見表8。可見酒制白芍確實(shí)提升了復(fù)方中阿魏酸的含量。

表8 驗證實(shí)驗結(jié)果

3 討論

阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓，清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基，抗菌消炎，抗腫瘤，抗突變，增加免疫的功能[9]。四物湯和阿魏酸均可使骨髓網(wǎng)織紅細(xì)胞中微管內(nèi)細(xì)胞質(zhì)明顯增多，有可能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，對骨髓造血功能起保護(hù)作用[10]?？梢姲⑽核崤c四物湯的補(bǔ)血活血作用有較強(qiáng)的相關(guān)性，阿魏酸含量的變化可能會影響到四物湯的補(bǔ)血活血作用。

研究表明，川芎、當(dāng)歸酒制后阿魏酸含量均略有下降[11-13]，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)果并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，本實(shí)驗的數(shù)據(jù)分析也沒有發(fā)現(xiàn)川芎和當(dāng)歸酒制對復(fù)方中阿魏酸含量有明顯影響；而文獻(xiàn)報道川芎、當(dāng)歸配伍熟地對阿魏酸的溶出具有助溶作用[14]，本實(shí)驗采用正交試驗設(shè)計，各實(shí)驗均配伍熟地一同煎煮，熟地對阿魏酸的助溶作用在各實(shí)驗中具有均等的機(jī)會，因此本實(shí)驗結(jié)果可以突出顯示飲片酒制處理對整個復(fù)方中阿魏酸含量的影響。

白芍不同炮制品芍藥苷含量大小為生白芍>炒白芍>醋白芍>酒白芍，說明白芍酒制后會降低芍藥苷的含量[15]，但本研究在四物湯復(fù)方中未發(fā)現(xiàn)芍藥苷含量降低的證據(jù)，反而通過正交試驗和對比實(shí)驗證實(shí)酒制白芍的確會升高四物湯復(fù)方中和白芍無關(guān)的阿魏酸的含量。對于芍藥苷來說也可能存在另一種可能，白芍酒制后會降低芍藥苷含量，但在四物湯復(fù)方中其他飲片可能有利于提升芍藥苷含量，一降一升，在復(fù)方中沒有發(fā)現(xiàn)芍藥苷含量的變化?？梢娭兴庯嬈呐谥瞥藭鹱陨砘瘜W(xué)成分的變化，還可能會影響到復(fù)方中其他化學(xué)成分的變化，這是值得重視的一個中藥炮制研究思路。

4 結(jié)論

實(shí)驗表明，酒制白芍、酒制川芎和酒制當(dāng)歸對復(fù)方中5-羥甲基糠醛和芍藥苷的含量影響不大，而酒制白芍配伍的四物湯與生白芍配伍的四物湯中阿魏酸含量有顯著性差異，提示酒制白芍有利于提高四物湯復(fù)方中阿魏酸的含量。