鄭鈺婷 胡宇如 胡方平 蔡學清

(福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002)

作物青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)引起的一種典型的細菌性維管束病害，是農作物特別是茄科作物如番茄、辣椒、馬鈴薯和煙草等生產上的重要限制因子，造成了不可挽回的經濟損失[1-3]。目前作物青枯病的防治方法包括農業(yè)防治[4]、化學防治[5]及生物防治[6]等，其中化學防治是主要的防治方法之一，但化學防治易使病菌產生抗藥性且易造成環(huán)境污染[7]；生物防治具有無污染、無公害、經濟長效等優(yōu)點，逐漸成為研究的熱點[8]，但如何高效篩選并獲得有用的生防細菌是植物病理學家一直探討的問題。

目前最常用的篩選方法是室內平板篩選，這種篩選方法比較省時快速，但室內平板篩選結果與盆缽及田間的防效不一定成正比[9-10]。其次，田間防效測定篩選較常用，該方法獲得的菌株比較可靠，但工作量大且時間長。已有研究發(fā)現(xiàn)，細菌中普遍存在群體感應(quorum-sensing，QS)現(xiàn)象，它們通過感應特定信號分子濃度變化來感知周圍環(huán)境中自身或其他細菌的數量，并調整相關基因表達以適應環(huán)境變化[11-12]。許多重要生物學功能如致病因子的表達、色素的產生、抗生素的合成和生物群游現(xiàn)象等都會受到QS系統(tǒng)的調控[13-14]，上述調控均通過各種信號分子來完成。據報道，革蘭氏陰性細菌中的QS系統(tǒng)信號分子大多為N-?；呓z氨酸內酯(N-acylhomoserine lactones，AHL)[15]，因此AHL信號分子可作為防治植物細菌病害的新靶標位點；將其破壞后可抑制細菌QS系統(tǒng)的調控，其相對應的細菌生物學功能基因就會受到抑制，這種對細菌QS調控機制的干擾和破壞稱為群體感應淬滅 (quorum quenching，QQ)[16]。如芽胞桿菌屬(Bacilllus)中就含有N-酰基高絲氨酸內酯酶基因(autoinducer inactivation gene，aiiA基因)，其編碼的AiiA蛋白能水解歐文氏菌(Erwinia)產生的AHLs信號分子的內酯環(huán)，使其失活，從而抑制其致病基因的表達，降低病原菌的致病性[17]；陳珺君等[18]將aiiA基因導入多黏芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)NR1后，發(fā)現(xiàn)其對胡蘿卜歐文氏菌(E.carotovora)具有一定的抗菌活性，證明含有aiiA基因的生防細菌對具有AHL群體感應調控系統(tǒng)的植物病原細菌具有抑制作用。

作物青枯病菌具有典型的AHL群體感應調控系統(tǒng)[19-20]，因此本研究擬通過aiiA基因引物進行PCR擴增快速篩選具有aiiA基因的生防細菌菌株，進一步結合室內盆缽防效測定獲得具有防效的生防細菌菌株，并明確其分類地位，旨在為田間作物青枯病的生物防治提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：煙草青枯病菌(R.pseudosolanacearum)Z5由福建農林大學植物細菌實驗室分離鑒定及保存；枯草芽胞桿菌(B.subtilis) 標準菌株BS168和生防菌株由福建農林大學植物細菌實驗室保存。

供試煙草品種：翠碧1號，由福建省三明市煙草公司提供。

1.2 主要儀器與設備

TProfessional Standard Gradiena96 PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司；Fire-readerV4型凝膠成像儀，英國UVItec公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；ZHWY-211B型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；PRX-350B型恒溫培養(yǎng)箱，寧波賽福實驗儀器有限公司；BioDrop Duo型超微量核酸蛋白分析儀，英國Biochrom(柏楉)有限公司；YXQ-LS-50G高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；AB104-N型電子分析天平，梅特勒托利多儀器公司。

1.3 細菌的培養(yǎng)方法

生防細菌的培養(yǎng)：取-75℃冷凍保存的待測菌株在營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)平板培養(yǎng)基[21](牛肉浸膏3.0 g、酵母浸膏1.0 g、葡萄糖1.0 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2)上活化，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于未加瓊脂的NA培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(37℃，180 r·min-1)48 h，用無菌水將其濃度稀釋到OD600值為1.0，備用。

青枯病菌的培養(yǎng)：取-75℃冷凍保存的待測細菌菌株在氯化四唑(tetrazolium chloride medium, TZC)[21](蛋白胨10. 0 g、葡萄糖5.0 g、干酪素1.0 g、瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2)平板培養(yǎng)基上活化，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于未添加瓊脂的NA培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(28℃，180 r·min-1)24～48 h，用無菌水將其濃度稀釋到OD600值為0.8， 備用。

1.4 含aiiA基因菌株的篩選

采用菌落PCR擴增法，引物aiiA1/aiiA2序列及其 PCR擴增體系參照黃天培等[22]的方法。

1.5 生防菌株對煙草青枯病的盆栽防治試驗

1.5.1 煙苗培育 將煙草種子播入穴盤中，7～10 d出芽，待長到4～5片真葉時進行試驗。

1.5.2 接種方法 設計以下4個接種處理：處理1：無菌水對照(control，CK)；處理2：煙草青枯病菌菌液；處理3：生防細菌菌液+煙草青枯病菌菌液；處理4：化學藥劑(氫氧化銅1 000×)+煙草青枯病菌菌液。采用傷根澆灌法，即處理1和處理2的煙苗澆灌接種30 mL無菌水，處理3的煙苗澆灌接種30 mL生防細菌菌液，處理4的煙苗澆灌接種30 mL化學藥劑(氫氧化銅1 000×)，24 h 后，處理1的煙苗澆灌接種30 mL無菌水，其余處理分別澆灌接種30 mL煙草青枯病菌菌液。

每個處理設3次重復，每次重復6株煙草苗。待煙株發(fā)病后，每隔7 d調查病情，病情分級標準及病情指數計算參照《GB/T 23222-2008煙草病蟲害分級及調查方法》[23]。

病情指數=∑﹙各級癥狀代表值×株數﹚/﹙最高級癥狀代表值×總株數﹚×100

(1)

防治效果=[﹙對照的病情指數-處理的病情指數﹚]/對照的病情指數×100%

(2)。

1.6 生防菌株的鑒定

1.6.1 生理生化測定 以枯草芽胞桿菌(B.subtilis) 標準菌株BS168為對照菌株，參照東秀珠等[24]的方法進行菌落形態(tài)特征觀察、革蘭氏染色反應、耐鹽性和運動性測定、液體培養(yǎng)物靜置觀察試驗、檸檬酸鹽利用測定、丙二酸鹽利用測定、糖類利用測定、淀粉水解測定、接觸酶測定、甲基紅試驗、V-P試驗和七葉靈水解試驗。

1.6.2 分子生物學鑒定 采用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取生防菌株的基因組DNA，使用16S rDNA通用引物27F/1492R[25]和gyrB基因特異引物[26]進行PCR擴增，擴增產物送上海生物工程有限公司測序，序列通過NCBI在線比對，利用 Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 含aiiA基因生防細菌的篩選結果

使用aiiA基因特異性引物對供試的253株菌株進行PCR擴增，其中有12株菌株擴增出單一、清晰的目標條帶，大小為750 bp(圖1)，與目標條帶預期大小相近，表明這12株菌株含有aiiA基因，分別為Syy9、X2、X4、Gbb5、Syb3、B15、F47、F11、F24、BL3、F96和Y3菌株。

注：M: DL 2 000 marker；1：無菌水；2～13生防菌株。

2.2 生防細菌對煙草青枯病的防治效果

采用傷根接種法測定供試菌株對煙草青枯病的防治效果，結果表明，供試的生防細菌(Syy9菌株除外)對煙草青枯病均有一定的防治效果，未經生防細菌處理的煙苗在接種煙草青枯病菌后5 d開始發(fā)病，而生防細菌處理過的煙苗在接種煙草青枯病菌后7 d開始發(fā)病。其中接種處理后7 d，對煙草青枯病的防治效果大于60%的菌株有6株，F(xiàn)47、B15和X2菌株接種處理的防治效果大于90%；接種處理后14 d，防治效果大于等于60%的菌株仍有2株，分別為B15和Gbb5，此時只接種煙草青枯病菌的煙苗病情指數為83.33，而防治效果較好的生防細菌菌株B15和Gbb5處理的煙苗病情指數分別為26.39和33.33，防治效果分別為68.33%和60.00%。與化學藥劑氫氧化銅(1 000×)的防治效果無顯著差異；接種處理后21 d，生防細菌B15菌株處理的防治效果仍有44.45%，顯著高于化學藥劑氫氧化銅(1 000×)處理的防治效果(表1、圖2)。根據以上生防菌株對煙草青枯病的防效測定結果可知，菌株B15對該病害的防治效果最好，下面對該菌株的分類地位進行探討。

注：A：無菌水對照；B：煙草青枯病菌菌株Z5；C：化學藥劑Cu(OH)2；D：生防菌株B15。

表1 生防細菌對煙草青枯病的防治效果

2.3 生防菌株生理生化測定結果

B15在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，其菌落呈圓形，白色，表面有光澤且粗糙，革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀。該菌株可利用淀粉、檸檬酸鹽、阿拉伯糖、丙三醇、海藻糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、纖維二糖、麥芽糖和木糖，不能利用丙二酸鹽、甜醇和香葉醇，耐鹽性為7%，七葉靈試驗呈陽性，接觸酶測定、甲基紅試驗、V-P試驗均顯示為陰性。

表2 菌株B15的生理生化測定結果

圖3 基于16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于gyrB基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 分子生物學鑒定結果

用16S rDNA通用引物27 F/1492和gyrB基因特異引物UP-1/UP-2分別對菌株B15進行PCR擴增，獲得大小分別為1 553 bp和1 234 bp的序列片段。利用NCBI進行在線比對，分別采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)和最大似然法(maximum likelihood, ML)構建16S rDNA和gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、4)。結果顯示，菌株B15與蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)聚為一支。兩者遺傳距離最近，將其鑒定為蠟樣芽胞桿菌(B.cerens)。

3 討論

青枯病是農作物一類典型的土傳維管束病害，危害重，防治難。近年采用化學防治所導致的病菌抗藥性及環(huán)境污染問題越來越突出，因此，生物防治正成為研究熱點，而快速獲得高效抑菌作用的生防菌株是提高生防效果的前提。對于作物青枯病菌生防細菌的篩選，目前采用最多的篩選方法是在瓊脂培養(yǎng)基上選出抑菌圈較大的菌株，這種篩選方法可省時、快速獲得具有抑菌作用的生防細菌，但在室內離體條件下生防細菌抑制病原菌的能力與在盆缽及田間條件下活體抑制該病菌所致病害的能力不一定成正比，因此平板產生的最大抑菌圈的菌株并不一定是盆栽或田間防效最好的生防菌株[27]。如鄭雪芳等[28]采用抑菌圈法從不同地理來源的芽胞桿菌中篩選出24株對青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的菌株，其中菌株FJAT-11709對青枯雷爾氏菌的抑菌能力(抑菌圈直徑14.78 mm)較菌株FJAT-20261(抑菌圈直徑14.15 mm)強，但其對番茄青枯病的防效(13.97%)卻比菌株 FJAT-20261的防效(72.73%)差。何玉安等[29]采用抑菌圈法篩選出2株抗青枯病菌的菌株，其中LSN02的抑菌能力(抑菌圈直徑29.96 mm)較菌株 LLGJ04(抑菌圈直徑38.65 mm)弱，但用不同濃度的LSN02 菌液處理煙草時，煙草青枯病的病株率均低于菌株 LLGJ04。這種篩選方法的確可以獲得有用的生物因子，但工作量大且耗時長。近幾年研究表明，群體淬滅通過阻斷微生物間的信號交流，可使其成為“聾啞”個體[30]。其中利用群體感應淬滅酶(quorum quenching enzymes)降解微生物信號分子是目前毒性最小、最為安全有效的群體感應淬滅途徑，由aiiA基因編碼的群體感應淬滅酶——AiiA酶，可通過降解信號分子AHLs，減輕或消除病原菌的致病性，從而達到防治動植物病害的目的[31-32]。如Qian等[33]將aiiA基因轉化生防細菌產酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)OH11菌株后，獲得的突變株具有抑制植物軟腐病病原果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)的能力，并能夠減輕其在大白菜和仙人掌上造成的軟腐癥狀。Anandan等[34]發(fā)現(xiàn)含有aiiA基因的內生蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)菌株KMCL07對銅綠假單胞菌PAO1具有群體淬滅活性。本研究中所用的aiiA基因擴增引物是由黃天培等[22]根據aiiA基因完整的開放閱讀框設計的一對簡并引物aiiA1/aiiA2，該引物可擴增不同種芽胞桿菌的aiiA基因，如蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)[35]、蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)[35]、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)[36]等，這些菌株能夠減輕由胡蘿卜果膠桿菌(P.carotovorum)引起的軟腐癥狀。因此利用PCR擴增的方法篩選具有aiiA基因的生防細菌，不僅可以縮短生防細菌的篩選時間，還能防止室內平板抑菌能力弱或無拮抗能力卻具有生防效果的菌株被遺漏。

本研究采用aiiA基因的簡并引物PCR擴增獲得的12株菌株，盆栽防病試驗結果表明，這12株菌株對煙草青枯病均有一定的防治效果，其中一株鑒定為蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)的B15菌株在室內盆缽條件下對煙草青枯病的防治效果最好，接種處理后14 d時對煙草青枯病的防治效果為68.33%；該菌株由于含有aiiA基因，推測其可能通過合成AiiA蛋白降解青枯病菌體內的群體感應信號分子 AHLs蛋白，從而降低煙草青枯病菌的致病力；另外，該菌株從福建農林大學植物細菌實驗室構建的內生細菌庫中篩選獲得，由于植物內生細菌存在于植物體內, 受到植物體的保護，不易受外界環(huán)境的影響，且能在植物體內定殖傳導, 可長期發(fā)揮作用。本研究為作物青枯病生物防治提供了新的生防菌株資源，但關于該菌株的安全性、內生定殖和防病機制等問題仍需進一步深入探討。

4 結論

本研究使用簡并引物aiiA1/aiiA2擴增獲得12株具有aiiA基因的生防細菌，進一步通過室內盆缽防效測定，獲得一株對煙草青枯病具有較好防治效果的生防細菌菌株B15，該菌株處理后使煙草青枯病推遲2 d 發(fā)生，接種處理14 d后，對煙草青枯病的防治效果為68.33%。根據其菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色反應、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB基因序列分析，確認為蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)。本研究篩選獲得的菌株可為作物青枯病的生物防治提供新的菌株資源。